机械敏感分子踝蛋白与动脉粥样硬化

李史恬 李静 李玲

(新疆医科大学 1基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2第一临床医学院；3药学院)

理解外力刺激对细胞产生的影响需要运用生物化学和生物力学相互结合的整体研究方法。近年来，显微镜技术和生物物理技术领域的进展使细胞生物力学的研究向前迈出了一大步，逐渐形成了新兴的生物力学学科。细胞通过黏着斑与其自身的机械环境进行信息传递，踝蛋白(Talin)是黏着斑中的重要成分，连接着整合素与肌动蛋白，可激活整合素。由于Talin与细胞机械力承载装置的关键部位相结合并在受到外力刺激时发生构象变化，因此，研究认为Talin是一种机械敏感分子，并且在整合素介导的力学转导中占据重要地位〔1，2〕。本综述介绍Talin的机械敏感结构及其与结合伙伴的协同作用，讨论了Talin与动脉粥样硬化(AS)的密切联系及Talin在癌症中的表达及调控。

1 Talin机械敏感结构

Talin于1983年被发现，因从人血小板中分离获得而得名〔3〕。Talin共有2 541个氨基酸残基，分子质量为270 kD，由N端头部结构域和C端的棒状尾部结构域连接而成。Talin头部呈球形，包括F0结构域和FERM结构域，FERM结构域存在于多种连接跨膜蛋白和细胞骨架的蛋白质中，由线性排列的F1、F2、F3子域组成；尾部的棒状结构域，由13个螺旋束(R1～R13)及C末端的最后一个α螺旋DD组成。两个Talin分子的DD结构可相互作用，介导Talin二聚体的形成〔4〕。棒状结构域的每个螺旋束由4～5个α螺旋组成，其内部形成稳定的疏水核心。因螺旋束种类及排列方式的不同，可形成两个功能不同的区域：5-螺旋束组成的线性排列的杆状域和3个4-螺旋束(R2-R4)所组成的紧凑排列的结构域，后者插入棒状结构域N端的R1与R5之间，R2通过其强大的疏水作用与R1结合成一个双结构域。R8虽为4-螺旋束，但因为它并非插入了R7与R9之间，而是插入了R7内部的α-螺旋环中，所以并未打破5-螺旋束的线性排列〔5〕。通过在体内对Talin分子单体进行追踪，Margardant等〔6〕证明了Talin在感应肌动蛋白的机械力时，会发生显著的构象变化。根据螺旋束的拓扑结构发现：4-螺旋束的N端和C端在空间上紧密排列且位于结构域的同侧；5-螺旋束的N端和C端首尾相接，分别位于结构域的两侧，为线性排列的长棒状结构。因此形成了Talin理想的机械力传导结构。

受到较低机械力作用时，Rap1-GTP交联受体蛋白(RIAM)与R2、R3结构域的结合占主导地位，协助细胞膜招募Talin、激活整合素及新生粘连的组装。然而当机械力大于5 pN时，R3结构域受到机械诱导展开后，RIAM结合位点遭到破坏，从而向纽蛋白(Vinculin)-Talin复合物过渡，促使新生黏附物成熟为黏着斑〔1〕。

2 Talin对整合素的激活

整合素是一种跨膜蛋白，其胞外基质(ECM)成分可将外界应力刺激传递到细胞内，同时β亚基胞内域与Tain N末端FERM域直接相连，将外界机械应力刺激信号转化为细胞内化学信号，实现力-化学信号转导过程〔7〕。整合素介导的黏附物机械敏感性允许组织调整其功能和基因表达以适应环境中的机械信号〔8〕。整合素激活伴随着其胞外结构域构象变化，Talin的一个重要功能就是将整合素转化为与ECM配体高亲和力结合的构象，即所谓的“由内而外”激活。从细胞内部调控整合素活性对造血细胞尤其是血小板和淋巴细胞尤为重要〔9〕。

带负电荷的磷脂酞肌醇(PI)对分布在Talin蛋白FERM结构域一侧的连续碱性残基有静电吸引作用，使得Talin靠近细胞膜，Talin依靠头部F3亚结构域上的类磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域与整合素β亚基胞内天冬酰胺-脯胺酸-Xaa-酪氨酸(NPxY)序列结合，使整合素的α、β亚基之间盐键断裂，导致整合素活化，进而引发下游细胞信号转导〔5〕。研究表明，肌动蛋白聚合和肌凝蛋白收缩所产生的力能够诱导或稳定整合素激活构象〔10〕。

3 踝蛋白-纽蛋白结构在机械力转导中的作用

Talin是机械力感应分子，而Vinculin是关键的机械效应物之一。早期的结构研究表明Talin与Vinculin的相互作用需要Talin中螺旋束的展开，接着Vinculin与之前被掩盖的纽蛋白结合位点(VBSs)结合〔11〕。分子动力学模拟实验表明，在螺旋束两端施加机械力可加速VBSs的暴露〔12〕。在细胞中，Vinculin存在活化和非活化两种构象。非活化时处于自我抑制状态，首尾相接，在受到外力时，Talin和肌动蛋白微丝分别与Vinculin的头部(Vh)及尾部(Vt)功能域相结合，共同介导Vinculin的活化，使其向整合素募集，共同形成黏着斑，研究发现这种募集作用受到力学刺激的诱导〔13〕。Del等〔14〕在单分子实验中发现，在Talin N端施加大约12 pN的力，即可显著增加Vinculin头域与Talin的结合，提示力学刺激可诱导Vinculin的活化及其向黏着斑的募集。Ciobanasu等〔15〕发现，肌动蛋白收缩时作用于Talin全长的力增加了Talin与Vinculin的亲和力。

4 踝蛋白-肌动蛋白结构在机械力转导中的作用

Talin包含3个肌动蛋白结合域(ABDs)。ABD1跨越FERM域的F2和F3子域；ABD2位于棒状结构域的中心，位于Talin蛋白的C末端〔16，17〕。成熟黏着斑的纳米级组织显示，Talin N端的ABD1位于细胞膜的近端，而ABD3则向细胞深处延伸以固定肌动蛋白应力纤维〔18〕。在此构象中，Talin作为机械传感器，将机械力从肌动蛋白细胞骨架传递给黏着斑，这种特性使Talin能够感受到ECM硬度〔19〕。实验表明〔14〕，Vinculin与VBSs结合后，肌动蛋白结合位点暴露，即Vinculin尾巴，从而加强了肌动蛋白的锚定。

5 踝蛋白与AS

AS是一种高度复杂的疾病，其特征是进展性的内皮损伤、动脉炎症、血流动力学改变和血管重构，并导致斑块形成、进展和破裂〔20〕。一个多世纪前，Virchow提出血液流动和停滞导致血栓形成的假说，而在近50年前已提出血流动力学改变影响AS发生的观点。

5.1AS斑块病理 AS斑块内含有的各种细胞中，血管平滑肌细胞(VSMCs)来源的细胞占70%左右，表明VSMCs增殖是AS斑块形成的基础〔21〕。VSMCs分为收缩型和合成型，二者间可发生表型转化并受基因调控。胚胎发育时，VSMCs通过表达平滑肌细胞肌动蛋白(SM α-actin)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)及钙调节蛋白等收缩蛋白基因使细胞由合成型转化为收缩型；当细胞处于炎症、应激或应力刺激等因素下，VSMCs通过下调上述基因表达，使细胞去分化转化为合成型，获得再增殖和分泌能力〔22〕。部分合成型VSMCs合成ECM并摄取脂质变为泡沫细胞，其余大量增殖，致使脂质沉积、内膜增厚，成为AS的病理学基础〔23〕。

5.2AS的血流动力学机制 对AS病变部位进行总结分析后发现，AS病变主要见于呈现异常切应力模式的动脉弯曲和分叉处，表明AS的发生与血流动力学有因果关系，进一步研究发现病灶分布和病理生理学改变与壁面剪切应力有关〔24〕。低剪切应力是AS形成公认的危险因素。孙涛等〔25〕根据流体力学原理，采用自行设计的楔形颈总动脉套管植入兔颈总动脉，发现低剪切力区域形成斑块组织且其中脂质成分增加、平滑肌细胞增殖，证明低剪切力可诱导AS的发生。低剪切应力主要通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子(NF)-κB及蛋白激酶(PK)Cξ等信号通路发挥作用，诱导炎症细胞黏附分子的产生、增加脂质摄取并增高内皮渗透性，从而造成血管内皮损伤，引发慢性动脉炎症、脂质累积和氧化、内膜增生和凋亡等病理过程，最终导致脂质斑块的发生发展〔26，27〕。剪切应力反映血流对血管壁产生的切向摩擦力，与血液黏度和血流速度呈正比。目前，力学信号转导领域认为，机械应力刺激首先激活细胞膜上机械感受器，包括整合素、受体酪氨酸激酶(RTK)、小G蛋白和离子通道等；然后通过分子构象改变将机械刺激转化为化学信号，继而激活下游信号通路，最终导致VSMCs细胞分化、增殖或凋亡等生物学效应〔28〕。

5.3踝蛋白在AS中的表达及作用 Von等〔29〕通过微点阵分析和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析Talin-1、Talin-2基因在AS斑块中的表达，发现Talin基因在斑块(颈动脉、腹主动脉和股动脉区域)中的表达与对照组相比均显著且持续下调；通过免疫组化方法观察到Talin基因在AS不稳定斑块中有进一步下降的趋势，表明Talin表达下调可能导致组织对机械冲击的耐受性降低且愈合能力受损，引起AS斑块破裂，提示受损的组织机械稳定性影响组织重塑和愈合能力，导致不稳定斑块形成。陈道运〔30〕利用脉动模式张应力系统研究发现，在周期性应变的作用下，Talin在VSMCs中表达逐渐增加且发生快速磷酸化，并应用酪氨酸磷酸化抑制剂通过分级阻断证明ECM-整合素-骨架蛋白-细胞骨架是周期性应变促进VSMCs增殖的重要信号通路。

综上，Talin作为整合素/Talin介导的机械力转导通路中首个被证实能与整合素胞内段结合的细胞骨架蛋白，可将来自ECM的机械应力传递至细胞内，同时也将细胞骨架产生的牵引力传递至ECM。整合素/踝蛋白介导的机械感应在生理状态及包括癌症、高血压和纤维化在内的多种疾病中都具有重要作用。一些公认的抗肿瘤药物可直接针对细胞中Talin的表达水平进行靶向治疗，如在前列腺癌和结肠癌中受到广泛研究的白藜芦醇，还有多沙唑嗪衍生物——DZ-50，两者都被证明可以降低癌细胞中Talin的表达水平，表明Talin有望成为癌症分子治疗的新靶点〔31，32〕。