两种测定食用植物油中叔丁基对羟基苯二酚的方法比较
2020-01-14刘超景赞黄志勇
刘超，景赞，黄志勇
（乐山食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）
食用植物油在家庭厨房里不可缺少，同时它也是人体所需营养的重要来源。随着近代工业的发展，为了增加食用植物油的保质期，允许往食用植物油中添加丁基羟基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、二丁基羟基甲苯（TBHQ）、特丁基对苯二酚等抗氧化剂。与BHA、BHT相比，TBHQ更安全，对人体健康影响更小[1]，因此，更受广大生产厂家的喜爱。有报道研究TBHQ对实验动物的胃具有一定的副作用[2]，在不同国家的使用规则不同，在欧盟和日本禁止在食品中使用[3]，我国食品添加剂使用标准规定，在食用植物油中TBHQ最大使用限量为0.2 g/kg[4]。
目前，TBHQ常用检测方法有高效液相色谱法[5]、气相色谱法[6]、液质联用法[7]等。高效液相色谱法具有操作简单、稳定性高等特点；液质联用法具有定性能力高、选择性高、灵敏度高等特点。本文在GB 5009.32-2016[8]基础上，对两种方法进行了比较，以期探索TBHQ检测的最适宜方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇，99.9%，色谱纯，天津康科德科技有限公司；乙腈，99.9%，色谱纯，天津康科德科技有限公司；甲酸，色谱纯，天津市大茂化学试剂厂；叔丁基对羟基苯二酚（TBHQ）（0.25 g、99.2%，Lot：G162174 Dr.Ehrenstorfer GmbH，12/2021）；水，实验室用超纯水。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪，配有紫外检测器，岛津公司DGU-20A；高效液相色谱-串联质谱仪，DGU-20A-API3200，AB公司；电子天平（精确度0.01 mg），XSE205，梅特勒-托利多集团；旋转蒸发仪，EVA50A，北京普立泰科仪器有限公司；凝胶渗透色谱仪，P270II，大连依利特分析仪器有限公司；微孔滤膜，有机相、0.22 μm。
1.3 高效液相色谱法测定食用植物油中TBHQ
1.3.1 色谱条件的确定
液相色谱柱：Kromasil 100-5-C18（3.9 mm×150 mm，5μm）；流动相：A-甲醇，B-0.5%甲酸；流速为1.0 mL/min；进样体积为10 μL，采用梯度洗脱，洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition
1.3.2 对照品溶液的配制
准确称取12.5 mg TBHQ至25 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即制得对照品储备液（500 μg/mL），避光，0～4 ℃储存。分别准确移取0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL对照品储溶液至5 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，配成10、20、50、100、150、200 μg/mL的对照品使用液。
1.3.3 样品的制备
（1）提取
精密称取混匀的食用油10 g于100 mL容量瓶中，以乙酸乙酯-环己烷（1+1）定容至刻度，摇匀，备用。从中取5 mL溶液至10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯-环己烷（1+1）定容至刻度，待净化。
（2）净化
取10 mL待净化液加入凝胶色谱进样管中，使用凝胶色谱净化，收集流出液，40 ℃下旋转蒸发至干，加2 mL乙腈溶解，用甲醇定容至5 mL，过0.22 μm的有机相微孔滤膜，备用。
凝胶色谱条件如下：凝胶色谱柱为300 mm×20 mm玻璃柱，Bio Beads（S-X3），40～70 μm；流动相为乙酸乙酯:环己烷（1:1）；流速为5 mL/min；流出液收集时间为7～17.5 min；紫外检测波长为280 nm。
1.3.4 方法的检出限
精密称取混匀的食用油10 g于100 mL容量瓶中，加入0.5 mL、5.0 μg/mL的TBHQ对照品使用液，以乙酸乙酯-环己烷（1+1）定容至刻度，摇匀，备用。从中取5 mL溶液至10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯-环己烷（1+1）定容至刻度。取10 mL待净化液加入凝胶色谱进样管中，使用凝胶色谱净化，收集流出液，40 ℃下旋转蒸发至干，加2 mL乙腈溶解，过0.22 μm的有机相微孔滤膜，进样，信噪比S/N≥3即可。
1.3.5 方法的回收率和重复性
为验证方法的稳定性和准确性，对食用油分别进行10、20、30 μg/mL这3个水平加标回收试验，测得TBHQ的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度及其RSD，获得准确性及重复性结果。
1.4 LC－MS/MS测定食用植物油中TBHQ
1.4.1 液相色谱条件
液相色谱柱：Kromasil 100-5-C18（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流动相：A-乙腈，B-水；流速：0.4 mL/min；进样体积：10 μL。梯度洗脱，条件见表2。
表2 梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution condition
1.4.2 质谱条件
质谱模式为ESI负离子模式，离子源参数见表3，多反应检测参数见表4。
表3 离子源参数Table 3 Ion source parameters
表4 多反应检测参数Table 4 Detection parameters of multiple reaction
1.4.3 对照品溶液的配制
准确称取10 mg TBHQ至100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，制得对照品储备液（100 μg/mL），避光，-20 ℃储存。移取一定体积的对照品储备液至50 mL容量瓶中，空白基质溶液定容，配成浓度为1、2、5、10、20、50 ng/mL的标准曲线。
1.4.4 样品的制备
同1.3.3高效液相色谱样品制备方法。
1.4.5 方法的检出限
同1.3.4高效液相色谱检出限的制备方法。
1.4.6 方法的回收率和重复性
为验证方法的稳定性和准确性，对食用油分别进行2、4、16 ng/mL这三水平的加标回收试验，测得TBHQ的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度及其RSD，获得准确性及重复性结果。
2 结果与分析
2.1 高效液相色谱方法
2.1.1 标准曲线
图1 液相色谱检测TBHQ的标准曲线Fig.1 Standard curve of TBHQ by HPLC
从图1可以看出，TBHQ在10～200 μg/mL的浓度范围内R值为0.999 9＞0.99，线性范围良好[9]。选取10～200 μg/mL为本试验的线性范围。
2.1.2 检出限
信噪比S/N=42.5，达到GB 5009.32-2016确定的检出限为10 mg/kg。
2.1.3 方法回收率和重复性
TBHQ在10、20、30 μg/mL这3个水平的回收率依次为71.7%、82.4%、87.5%，重复性依次为2.4%、1.9%、1.0%。数据显示该方法的回收率整体偏低，可能存在的原因是样品经过GPC净化，损失较大；重复性RSD＜5%，表明该方法的重复性良好[10]。
2.2 高效液相色谱串联质谱法
2.1.1 标准曲线
从图2可以看出，TBHQ在浓度1～50 ng/mL范围内R值为0.999 7＞0.99，可见TBHQ在上述线性范围良好。因此，选取1～50 ng/mL为本试验的线性范围。
图2 液质联用检测TBHQ的标准曲线Fig.2 Standard curve of TBHQ by LC-MS/MS
2.1.2 检出限
采用空白加标方法测定检出限[11-12]，按1.3.4制备，进样，信噪比S/N=42.5，检出限结果为1.08 μg/kg。
2.1.3 方法的准确性及重复性
表5 不同水平浓度下的TBHQ回收率和稳定性（n=6）Table 5 Recoveries and stability of TBHQ at diffterent levels concentration（n=6）
TBHQ在2.0、4.0、16.0 ng/mL这3个水平的回收率分别为58.2%、65.5%、69.3%，重复性分别为3.9%、3.7%、1.0%。回收率较液相色谱法略低，这可能是液质联用存在基质效应的原因，虽然采取基质溶液配标，但是不能彻底消除基质效应。重复性RSD＜5%，表明该方法重复性良好。
3 结论
本试验用高效液相色谱法检测食用油中TBHQ，对液相色谱法检测食用油中TBHQ方法学进行了考察。结果显示，GB 5009.32-2016中液相色谱法采用凝胶色谱的净化方法，有效避免了假阳性的现象；但是回收率略低，原因在于凝胶色谱净化回收率太低。本试验还采用液质联用法检测了食用油中TBHQ，并对该法检测食用油中TBHQ方法学进行了考察。结果显示，GB5009.32-2016中液质联用法回收率太低，原因可能是由于基质效应的存在及凝胶色谱的应用。总的来说，液相色谱法测定TBHQ回收率较高，建议用液相色谱法检测食品中TBHQ。
