冬瓜、蒲公英酵素发酵过程中亚硝酸盐含量及其抗氧化活性测定

常桂芳，祝贺,2，田莹莹，迟晓君，崔钰，邢艳霞*

（1.山东农业工程学院食品科学与工程学院，特色农产品采后品控与综合利用实验室，山东济南 250100；2.中南林业科技大学，稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南长沙 410000）

酵素又被人称作“酶”，狭义指具有催化功能的一种特殊的蛋白质[1]。但从严格意义上讲，酵素并不能完全称作酶，现在酵素涵盖面较广，既包括具有催化作用的酶，也包括可以产生酶的微生物及其他有关的调节因素。酵素属于发酵制品，与我国古代流传下来的酿酒和通过发酵产生酱品的工艺有所相似。酵素功效较多，如美容养颜、减肥减脂、抗炎消毒、促进消化、促进能量吸收等[2-4]。酵素还具有抗氧化活性[5]，可减轻人体内多余自由基对机体的损伤。冬瓜和蒲公英都是药食同用的植物，含有较高营养价值。同时，冬瓜是凉性的，具有消炎、解渴、杀毒的作用。蒲公英有利于人体健康，具有利尿、利胆、缓解腹泻等功效，是当下的健康绿色食品。

目前，人们对食品的需求从化工合成逐渐转向食品自然制作工艺方向转化，传统天然发酵工艺悄然兴起，酵素产品在我国发展迅速，市场上开始出现原料种类芜杂、功能性成分多样的酵素产品，市场潜力大。但酵素相关国家标准还未健全，行业乱象时有发生。蔬菜水果在发酵过程中会产生致癌物亚硝胺的前体——亚硝酸盐，它在体内可以转化为亚硝胺，长期摄入亚硝酸盐会增加致癌隐患[6]。且天然发酵过程菌种复杂，极易被污染。基于此，本文以蒲公英、冬瓜为原料，在传统工艺的基础上加一定量菌种进行制作，在缩短了蒲公英酵素的成熟时间、降低酵素发酵所需各种条件的同时，使有益发酵菌提前挤占，不易被杂菌污染，为确定蒲公英酵素和冬瓜酵素的发酵周期以及产品开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

新鲜冬瓜、蒲公英叶；酵素专用发酵菌粉（干酪乳杆菌:长双歧杆菌:嗜热乳杆菌:植物乳杆菌:乳双歧杆菌=2:2:1:1:1，纯度98%）。

分析天平（精度为万分之一），FA1004，上海第二天平仪器厂；专用酵素发酵桶，10 L，品牌为和风来；恒温发酵培养箱，DH400A，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 冬瓜酵素制作工艺

挑选→清洗→晾干称质量→去皮→切块→热烫→放入容器→加糖水→加酵素粉→加水→搅拌→封盖→恒温培养。

1.2.2 蒲公英酵素制作工艺

挑选→清洗→晾干称质量→热烫→放入容器→加糖水→加酵素粉→加水→搅拌→封盖→恒温培养。

1.3 测定指标与方法

发酵期间每12 h分别取两种酵素样液进行亚硝酸盐、总酚及维生素C的测定。亚硝酸盐采用国标GB5009.33-2016第二法——分光光度法（盐酸萘乙二胺法）测定[7]；总酚采用福林酚法测定[8-9]；维生素C采用紫外分光光度法测定[10-11]。

1.4 统计分析

数据处理采用Excel作图、SPSS17.0进行平均值和标准差计算、Duncan多重比较（P＜0.05）、相关性分析，Origin8.0进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中亚硝酸盐含量变化

由图1可以看出，冬瓜酵素和蒲公英酵素在发酵过程中亚硝酸盐含量先上升后下降，上升可能是因为酵素菌将酵素原液中的营养物质进行分解，使蒲公英酵素和冬瓜酵素中原有的硝酸盐还原成亚硝酸盐，并且冬瓜、蒲公英的维生素C和酚类等抗氧化性物质逐渐溶出，它们具有抑制硝酸盐氧化成亚硝酸盐的能力，从而总体上使得亚硝酸盐含量上升；后来下降可能因为乳酸菌数量的不断增加，使氧气含量不断降低，导致供氧不足，且乳酸菌通过代谢活动产生的乳酸达到一定水平，抑制了乳酸菌本身的生命活动，使乳酸菌还原硝酸的酶活性降低，亚硝酸盐含量下降。

图1 亚硝酸盐含量变化趋势Fig.1 Change trend of nitrous acid content

试验后期，冬瓜酵素和蒲公英酵素中的亚硝酸盐因被氧化而含量下降，最后基本趋于稳定。冬瓜酵素亚硝酸盐在60 h达到最高峰，含量为5.76 mg/kg。蒲公英酵素亚硝酸盐在36 h达到最高峰，含量为3.13 mg/kg。由于现在我国关于食用酵素的产品质量和卫生安全标准还未出台，所以根据《食品安全国家标准 食品中污染物的限量GB2762-2017中蔬菜及其制品》中亚硝酸盐含量限量为20 mg/kg的标准。蒲公英和冬瓜酵素在发酵过程中的亚硝酸盐含量并未超标，符合国家标准。

2.2 发酵过程中总酚含量的变化

由图2可看出，两种酵素发酵过程中总酚含量增加，并呈先上升后下降的趋势。在发酵开始时，由于菌群通过代谢活动产生酶类和酸性物质，使冬瓜和蒲公英中的酚类物质扩散到酵素原液中，总酚含量上升，这与陈永芳等的研究结论相同[12]。发酵后期，因为酚类物质具有抑菌作用，酚类物质含量的增加会抑制酵素菌；同时某些乳酸菌在发酵过程中，也会产生一些酚酸脱羧酶，这种酶能使酚类物质之间相互转化，从而使得酚类物质的含量开始呈现下降趋势[12-14]。蒲公英酵素总酚含量在12 h达到最高值，含量为1.599 μg/mL，冬瓜酵素总酚含量在60 h达到最高值，含量为0.146 μg/mL，从两种原料来看，发酵过程中蒲公英酵素的总酚含量高于冬瓜酵素。

图2 总酚含量变化趋势Fig.2 Change trend of totalphenols content

2.3 发酵过程中维生素C含量的变化

图3 维生素C变化趋势Fig.3 Change trend of vitamin C

由图3可以看出，蒲公英与冬瓜酵素发酵过程中维生素C含量呈先上升后下降趋势。这可能是因为VC的溶出和菌群通过酶的作用合成了一部分维生素C，导致酵素中的维生素C含量上升，之后微生物的相关活动和利用使维生素C含量下降。另外，虽然酵素的酸性环境和黄酮类物质能保护其稳定性，但维生素C作为强还原性物质会有不同程度的流失。根据原料来看，发酵过程中蒲公英酵素维生素C含量整体高于冬瓜酵素中维生素C的含量。蒲公英维生素C含量在60 h最高，为7.35 μg/mL。冬瓜维生素C含量在48 h最高，为5.40 μg/mL。

3 结论

本试验对两种原料（冬瓜、蒲公英）制作的酵素进行亚硝酸盐含量的全过程检测，以防超标威胁食品安全，并对抗氧化活性典型代表物质总酚进行全过程测定，另外，为验证维生素C作为酵素的宣传标签是否确有其效，本试验还进行了全过程维生素C含量分析。结果表明，酵素发酵过程中，亚硝酸盐含量呈现上升后下降趋势，且全程符合国家食品中污染物限量标准，正常发酵情况完全不会引起亚硝酸盐含量的超标，试验还发现发酵过程中维生素C含量呈先上升后下降趋势，冬瓜酵素在48 h含量最高，蒲公英酵素在60 h含量最高，且72 h之后维生素C基本完全损失，这表明酵素的维生素C含量较有限，在目前市场上被夸大了宣传，总酚在12 h便达到峰值，之后含量下降并趋于平衡，整个发酵过程中总酚含量仍然较高，证明酵素具有较高的抗氧化活性及相应功能。