补肾养血祛浊方对肾性贫血大鼠血清及肾组织中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的作用研究*

吴心虹，李泰标，廖秋菊，何毅琪，林友益

福建省厦门市第五医院中医科(厦门 361101)

中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil gelatinase-aussociated lipocalin，NGAL)是脂笼蛋白(lipocalin)家族的新成员。笔者在前期通过对非透析肾性贫血患者进行临床观察[1]，证实NGAL介导的铁代谢途径对慢性肾脏病与贫血具有重要作用。血NGAL与尿NGAL对肾性贫血铁代谢的诊断更有临床应用价值，可能是反应铁代谢的新型指标。血NGAL主要反应肾功能下降和贫血程度，而尿NGAL是血NGAL升高的结果，亦反应了肾小管的损伤情况，故血清NGAL可能是肾性贫血的潜在作用点。Kim等[2]通过临床观察亦证实血浆NGAL水平与慢性肾病患者透析前贫血的铁状态相关。

补肾养血祛浊中药在临床上治疗肾性贫血取得较好的疗效，联合促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)治疗更有利于肾性贫血的纠正。然而研究多围绕疗效观察进行，具体机制研究文献报道较少，分子生物依据少。本研究通过补肾养血祛浊方干预肾性贫血大鼠，观察Scr、Hb、Fer、TAST改变，实时荧光定量 PCR (Real time，PCR) 检测肾组织NGAL、EPOR水平，Western blot 检测肾组织 NGAL及EPOR蛋白水平，从而阐述中药纠正肾性贫血的作用机理。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：健康SPF级 SD雄性大鼠共70只(体重180～220 g)，由厦门大学实验动物中心提供(许可证号：SYXK(闽)2013-0006)。

1.2 主要试剂：RNA提取试剂盒(Promega)；逆转录试剂盒(Promega)；SYBR®Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(TOYOBO)；NGAL ELISA试剂盒(Abcom)；EPO ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；EPOR ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；铁蛋白ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；兔抗大鼠NGAL、EPOR多克隆抗体(Proteintech)；蛋白提取试剂盒(Promega)。

2 研究方法

2.1 实验分组：将75只健康的SPF级大鼠，运用标准大鼠饲料适应性喂养1周后，随机分为5组，即正常组(N组)25只、模型组(M组)25只、中药组(Z组)25只。

2.2 模型建立及动物处理

2.2.1 造模：参照相关文献[3]，将1.5%腺嘌呤混悬液，以腺嘌呤300 mg/(kg·d)灌胃，共6周，正常组以等容量蒸馏水灌胃。造模期间15只大鼠死亡。造模6周后，随机选取4只大鼠，眼眶取血，检测Hb、Scr、BUN，证实造模成功。

2.2.2 本方组成：淫羊藿、鹿角胶、熟地黄、当归、黄芪、茯苓、大黄、补骨脂、鸡血藤等组成，生药制成浓缩汤剂。中药制法：①称取生药255 g，用水浸泡30 min，煮沸后再煎30min，过滤；②得滤渣,加水，加热(二煎)至沸腾后，再煎20 min，再过滤。每天上午灌胃给药，用量均按临床上成人每公斤体重用量的 6倍换算，予5 ml/(kg·d)灌胃；模型组予灌生理盐水10 ml/(kg·d)，给药时间为4周。

2.2.3 动物处理：采用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，开腹开胸后，取肾脏，处死前腹主动脉采血3 ml；左肾以多聚甲醛固定，梯度脱水、透明，进行石蜡包埋，制作石蜡切片，用于免疫组化检测；右肾用消毒锡箔纸包好速冻于液氮中，后转至-80°C 冰箱保存，用于实时荧光定量 PCR 及 Western blot检测。

3 指标检测

3.1 常规实验室法检测血清Hb、Scr、BUN、Fe、总铁结合力(TIBC)、血清铁(SI)水平，TAST由TIBC、SI计算得出。

3.2 ELISA法检测血清Fer、EPO、NGAL含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书执行。

3.3 实时荧光定量PCR检测肾组织NGAL mRNA、EPOR mRNA表达变化：取肾组织依照TRIzol(invitrogen)法提取总RNA，逆转录为cDNA，使用SYBR®Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(TOYOBO)以7500Software进行荧光扩增，检测基因序列详见表1，GAPDH作为内参照;以正常组 mRNA 的表达量作为“1”，再根据校正值计算出模型组及中药组mRNA相对含量，进行比较。见表1。

3.4 Western blot 检测肾组织NGAL、EPOR蛋白表达：组织称重，按比例加入相应裂解液，匀浆离心，抽取上清，BCA 法测定蛋白浓度。加入buffer，100°C 使蛋白变性利于保存。电泳分离，切胶，转膜，5% 脱脂奶粉室温封闭1h，加入1∶1000一抗(NGAL、EPOR，Proteintech公司)，4°C摇床孵育过夜，次日TBST洗涤后，加入过氧化氢物酶标记的二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次后，使用化学发光系统(ECL)检测标本膜上信号。

表1 检测基因引物序列和产物长度

结 果

1 各组大鼠血清指标比较 与正常组比较，模型组Hb、EPO均明显降低(P<0.01)，TAST降低(P<0.05)，NGAL水平升高(P<0.05)，Scr、BUN、Fer均明显升高(P<0.01)。与模型组比较，中药组Hb、TAST、EPO水平明显升高(P<0.01)，Scr、NGAL水平明显降低(P<0.01)，Fer、BUN水平均明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清指标表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01

2 各组大鼠PCR表达情况 与正常组比，模型组肾脏NGAL mRNA明显升高(P<0.01)，EPOR mRNA明显降低(P<0.01)，中药组肾脏NGAL mRNA升高(P<0.05)，EPOR mRNA升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组肾脏NGAL mRNA减少(P<0.05)，EPOR mRNA明显升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠PCR表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01

3 各组大鼠Western blot检测水平 模型组较正常组肾脏NGAL 蛋白水平升高(P<0.05)，中药组较模型组肾脏NGAL 蛋白水平减少(P<0.05)；模型组较正常组EPOR蛋白水平降低(P<0.05)，中药组较模型组EPOR蛋白水平明显升高(P<0.01)。见表4及图1-2。

表4 各组大鼠各蛋白表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01

讨 论

CKD发生的贫血是由于促红细胞生成素和铁缺乏、慢性炎症、继发性甲状旁腺功能亢进和红细胞缩短半衰期[4-5]。铁缺乏是CKD患者贫血的第二大原因，首要原因是促红细胞生成素缺乏。EPO 是红细胞生成的主要调控因子，通过和EPOR 结合发挥其促进红系祖细胞的增殖、分化与成熟的生物学效应[6-7]。在本实验中，模型组大鼠血清中Scr、BUN、Fer升高，Hb、血清EPO及肾脏EPOR水平降低，肾性贫血模型成立，但在造模过程中，大鼠死亡15只，考虑与该造模方法腺嘌呤用量较大有关。

NGAL是一个25kDa的中性粒细胞明胶酶单体，循环的NGAL可透过肾小球滤过膜。NGAL与肾脏病关系的相关研究报道已有不少，其水平与肾损害程度相关[8-9]，而NGAL亦参与贫血的发生发展，早期研究认为NGAL可通过Tf转铁途径参与慢性病贫血[10]，随着研究的进展，人们通过体外实验发现NGAL

也是调节红细胞生长机制的重要因素[11-12]。我们前期研究[1]，观察透析前CKD贫血患者NGAL与铁状态指数之间的关系，结果支持血浆NGAL与CKD贫血患者的铁状态有关，与Fer、TAST呈正相关，且特异性及敏感性均高于Fer。本实验中，模型组血浆及肾脏NGAL均升高，故考虑血浆NGAL升高与肾脏NGAL升高有关。

肾性贫血有关的病名如“虚劳”、“肾劳”、“血虚”等病名[13]。历代医家多认为本病病机为：肾精亏虚，脾气衰惫，后天无以滋养先天，脾肾俱虚，气血生化不足，浊邪内蕴，瘀血阻滞，可将其概括为正虚邪实。《张氏医通》曰“血之源头在乎肾”而《侣山堂类辨》云“肾为水脏，主藏精而化血”。肾藏精，肾虚精亏，精不生血，则致血虚。《宣明论方》谓：“湿气先伤人之阳气，阳气伤不能调通水道，亦使人真阴不能生长而耗阴液。”津血同源，阴液耗则阴血生化乏源。治疗多以补肾填精，健脾益气，养血泻浊为主。本方以补肾养血泻浊法为主，选用淫羊藿、阿胶、熟地黄、当归、黄芪、茯苓、大黄等药物组成方。方中药物有以下特点：淫羊藿温肾阳而不燥；淫羊藿、阿胶配合使用，意在阴中求阳，阳中生阴，阴阳生化无穷，以期阴平阳秘、肾元充裕之功。熟地黄味甘微温质润，既补血滋阴，又能补精益髓；当归多糖能提高动物白细胞和网织红细胞水平，促进红细胞及血红蛋白的生成，疗效优于铁剂。黄芪、茯苓健脾益气升清、补后天以助先天，生化有源，佐以大黄通腑降浊。全方共奏益精补血之功，更添温肾降浊之效，对肾性贫血有好的治疗作用。

包晓星等[14]运用健脾益肾泻浊方配合EPO治疗肾性贫血，结果表明能有利于体内肌酐、尿素氮等代谢产物的排除，减少毒素对造血细胞的抑制和破坏，改善贫血程度。范军等[6]研究发现补肾生血方可通过提高骨髓有核细胞 EPOR mRNA 表达量达到治疗肾性贫血的作用。有许多实验证明[15]，中医药可通过降低NGAL水平减少相关炎症细胞因子表达、抑制炎症反应、减轻氧化应激、抗细胞凋亡、诱导细胞自噬、抗肾间质纤维化等方式减轻肾小管损伤、肾小球硬化，抑制肾小球系膜细胞的增殖，保护肾组织，然而未见对肾性贫血的治疗作用。本实验中，中药组较模型组Scr、BUN明显降低，Hb、血清EPO明显升高，说明补肾养血祛浊方对肾性贫血有治疗作用。同时，与模型组比较，中药组Fer降低，TAST升高，血清NGAL、肾脏NGAL mRNA及蛋白水平均降低，说明该方可降低NGAL水平，改善肾性贫血铁代谢情况。

实验表明，补肾养血祛浊方能降低血清及肾脏NGAL水平，改善铁代谢情况，从而保护肾功能，纠正肾性贫血。为进一步了解NGAL在肾性贫血中的变化意义，今后将从细胞分子水平进一步研究。