益肾散结复方及其拆方对阿霉素肾病大鼠肾脏组织的影响研究*

王漱非，王悦彤，李现成，张 楠，赵亚峰，沈 霞，毛加荣，延 佩，王 宇，于小勇，程小红，屈 凯△

1．陕西省中医医院(西安 710003)；2．陕西中医药大学(咸阳 712046)

大鼠阿霉素肾病(Adriamycin-induced nephropathy，ADN)是通过阿霉素及其代谢产物诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化，破坏肾小球滤过膜结构和功能，最终导致滤过屏障的通透性而引起蛋白尿的一种肾脏病[1]。研究发现，蛋白尿是慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD) 进展至终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)的主要因素，随着蛋白尿的不断增多，最终导致不可逆性的肾小球硬化的发生。

现代医学在防治尿蛋白方面取得了一定的效果，但因其副作用多、依赖性强、价格昂贵等因素，限制了其广泛应用。大量的临床证据证实祖国医学对防治CKD具有确切疗效，发现中药在诸多方面对肾脏病理损害有明显的保护作用，能通过多种途径减轻肾组织病理改变，从而延缓肾脏病的进展。

益肾散结复方(又名“肾复康Ⅱ号胶囊”，专利号：ZL201110334097.6)，其由黄芪、山药、山萸肉、菟丝子、仙灵脾、丹参、金樱子、熟地等药物组成，其功效为补脾益肾、活血散结，该药物作为陕西省中医医院院内制剂临床应用十余年，取得了确切疗效[2-6]。本研究采用尾静脉注射阿霉素建模方法建立阿霉素肾病模型，观察益肾散结复方及其拆方组合对阿霉素肾病大鼠尿蛋白、血清学指标、肾脏组织形态学改变等的影响。现将其结果报告如下。

材料与方法

1 动 物 健康清洁级SD大鼠70只，雌雄各半，2～3月龄，体重(200±20)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(陕)2012-003，动物质量合格证号：No.0012260。实验动物按照组别采用分养法，在温度20℃～25℃，湿度55%～65%实验室内，均给予标准颗粒饲料喂养，自由饮水和自然昼夜节律光照。

2 药物及其制备 按照中医病机和组方原则为依据进行拆方，将益肾散结复方按照温肾益精化瘀组(菟丝子、淫羊藿、丹参、金樱子、姜黄)、滋阴益肾化瘀组(山茱萸、熟地黄、丹参、金樱子、姜黄)、益气化瘀组(黄芪、山药、丹参、金樱子、姜黄)的组方原则进行拆方实验研究。按上述分类及用药比例在陕西省中医医院制剂中心制备，低温冰箱保存。阳性对照组药物：盐酸贝那普利片，国药准字H20030514，北京诺华制药有限公司。造模药物：注射用盐酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)：上海金穗生物科技有限公司提供(批号C4125316-40-9)。HE、PASM、Masson染色试剂，10%甲醛、4%戊二醛、二甲苯、不同梯度乙醇、1%锇酸、PBS缓冲液、环氧树脂：陕西省中医医院病理实验室提供。

3 仪器与试剂 饲养笼、代谢鼠笼、梅特勒电子天平(AL104)、大鼠固定器、清洁工作台、一次性注射器(1 ml、5 ml、10 ml)、灌胃针头、莱卡肾组织平推式切片机、石蜡包埋机、烤片机、奥林帕斯显微镜、日立H-600电子显微镜等。

4 造 模 阿霉素肾病大鼠模型的建立。实验大鼠于实验第1天、14天给予尾静脉注射DOX6mg/只。造模成功后(24 h蛋白尿量≥100 mg/d)灌服相应药物2 ml/只/d，持续8周。

5 分组及给药 查随机数字表，从70只大鼠抽取10只为正常对照组大鼠，其余大鼠造阿霉素肾病模型。依据上述指标判断模型建立后，按体质量大小查随机数字表将60只模型大鼠分为6组：温肾益精化瘀组、滋阴益肾化瘀组、益气化瘀组、全方组、阳性对照组及模型对照组。于造模成功后的第2天开始分别给予不同治疗组对应药物，连续灌胃8周(参考实验动物学给药剂量确定给药量，根据大鼠与人体表面积及基础代谢率计算所得[6]，大鼠每千克体重给药量为成人每千克体重给药量的6倍，用药量为10 g/kg，即灌胃量10 ml/kg)。阳性对照组给予盐酸依那普利[盐酸贝那普利片的规格为10 mg/片，成人用量为20 mg/60 kg，换算后大鼠每天给药量为2.05 mg/kg，灌胃量10 ml/(kg·d)]，模型组给予灌服生理盐水2 ml/只/d，连续灌胃共8周。

6 样本采集和指标检测

6.1 24 h尿蛋白定量：尿蛋白浓度采用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue，CBB)法检测。送陕西省中医医院临床中心实验室采用Olympus AU2700自动分析尿蛋白浓度，计算24 h尿液及24 h尿蛋白定量。

6.2 血生化指标检测：通过相关指标试剂盒采用Beckman LX20生化分析仪自动分析血清中尿素氮(BUN)、血肌酐(CRE)、胆固醇(Cholesterol)、甘油三酯(Triglycerides)的浓度。

6.3 肾脏组织病理学变化的观察：取部分肾脏组织，置4%戊二醛固定，PBS缓冲液漂洗，1%锇酸固定，乙醇脱水后，浸透剂浸透,环氧树脂包埋浸蜡切片，甲苯胺蓝染色，超薄切片机切片5 μm，镜下观察肾脏组织结构变化。

结 果

1 益肾散结复方及拆方组合对大鼠尿量及尿蛋白定量的影响 与正常对照组比较，模型对照组尿蛋白定量明显上升(P<0.01),提示阿霉素造模对大鼠肾脏造成了影响，导致尿蛋白排泄增加；用药后，与模型对照组比较，各治疗组大鼠尿蛋白定量均有所下降(P<0.05)。同时，据数据分析，提示益肾散结全方改善尿蛋白疗效优于阳性对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠尿蛋白定量情况对比(mg/kg)

注：与模型组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.01；与阳性组比较，△P<0.05

2 益肾散结复方及拆方组合对大鼠血生化指标的影响

2.1 各组大鼠胆固醇情况分析：见表2。与模型组对照，治疗组、阳性对照组均有效改善胆固醇水平(P<0.01)；同时，益肾散结全方组改善胆固醇水平优于阳性对照组(P<0.05)。

2.2 各组大鼠甘油三酯情况分析：见表3。与模型对照组，治疗组、阳性对照组均能有效改善甘油三酯水平(P<0.01)；同时，温肾益精化瘀组、益气化瘀组、全方组改善甘油三酯水平优于阳性对照组(P<0.05)。

表2 各组大鼠胆固醇情况分析(mmol/L)

注：与模型组比较，*P<0.01；与阳性组比较，△P<0.05

表3 各组大鼠甘油三酯情况分析(mmol/L)

注：与模型组比较，*P<0.01；与阳性组比较，△P<0.05

2.3 各组大鼠血尿素氮情况分析：见表4。与模型组对照，各治疗组、阳性对照组均有效降低血尿素氮水平(P<0.01)；同时，全方组改善血尿素氮水平优于阳性对照组(P<0.05)。

2.4 各组大鼠血肌酐情况分析：见表5。与模型组对照，各治疗组、阳性对照组均有效降低血肌酐水平(P<0.01)；同时，温肾益精化瘀组、滋阴益肾化瘀组、益气化瘀组及全方组改善血肌酐水平优于阳性对照组(P<0.05)。

表4 各组大鼠血尿素氮情况分析(mmol/L)

注：与模型组比较，*P<0.01；与阳性组比较，△P<0.05

表5 各组大鼠血肌酐情况分析(μmol/L)

注：与模型组比较，*P<0.01；与阳性组比较，△P<0.05

3 电镜下组织形态学结构观察 见图1。正常对照组，肾小球系膜细胞和基质轻度增生，基底膜无明显增厚，足突节段性融合；模型组肾小球系膜细胞和基质轻-中度增生，足突广泛融合；盐酸贝那普利阳性对照组与温肾益精化瘀组、滋阴益肾化瘀组、益气化瘀组比较，系膜细胞核基质增生情况有改善，足突融合程度无明显变化；与益肾散结复方全方组比较，全方组肾小球系膜细胞和基质轻度增生情况较盐酸贝那普利阳性对照组改善明显，且足细胞仅显示部分融合，提示全方组修复能力最强。

A.正常对照组，B.阿霉素模型组，C.盐酸贝那普利阳性对照组，D.温肾益精化瘀组

讨 论

陕西省中医药研究院肾病研究所程小红主任医师基于多年临床经验，认为各类肾小球疾病的中医病理发展基础是因肾虚日久导致瘀血阻肾络，提出“益肾散结”的学术观点，组成益肾散结复方。课题组基于“益肾散结”的学术观点及前期研究结果，按照中医病机和组方原则为依据进行拆方，将益肾散结复方按照温肾益精化瘀组、滋阴益肾化瘀组、益气化瘀组的组方原则进行拆方实验研究，观察全方组及拆方组对阿霉素肾病大鼠体质量、血脂水平、血糖水平、尿蛋白定量、肾功能及肾脏组织形态学改变的影响，进一步证实其保护肾脏的有效性[7-10]。全方中黄芪、山药健脾益气以滋养先天，山茱萸补益肝肾，收敛固脱，“壮元气，秘精”，“功专助阳固阴”共为君药，菟丝子补肾固精，金樱子固精缩尿，共为臣药以助君药益肾之力；仙灵脾温肾壮阳为佐药，姜黄以活血化瘀散结，散体内凝滞之血，为使药，诸药相伍，以补脾益肾、活血散结之功，以此来抑制纤维化的发展保护肾功能[11-15]。

本研究选取经典的阿霉素肾病模型，采用尾静脉注射方式，造模后的大鼠与正常组大鼠相比，四足均较青紫，且活动度明显下降[16]，这些指征均类似于中医“肾虚血瘀”证的表现。故从状态观察，初步判断本模型比较符合益肾散结复方所治方证的中医证候学特征。本实验通过观察益肾散结全方及拆方组合对阿霉素肾病模型大鼠血生化、尿蛋白定量、肾脏组织形态学改变等的影响，研究结果显示，与正常对照组比较，阿霉素肾病造模大鼠生长速度缓慢，出现血脂代谢紊乱、尿蛋白及不同程度的肾功能下降。治疗后，阳性对照组、益肾散结复方全方组及拆方组均不同程度改善脂代谢紊乱，有效降低蛋白尿，改善肾功能，修复肾脏组织。进一步显示，全方组在控制蛋白尿、改善肾功能、修复肾脏损伤方面优于阳性对照组。此实验结果，为进一步开展细胞实验奠定基础。