均匀设计优化魟鱼中硫酸软骨素的酶解提取工艺

杨帆，张艺萍，杨凯瑜

福州大学至诚学院（福州 350002）

福建省海洋资源丰富，尤以鱼类资源更甚，以中国魟（Dasyatis sinensis）为代表[1]。中国魟主要分布于黄海、渤海和东海[2]，其肉质肥美，软骨资源丰富[3]。软骨质地较硬，不易消化，常被作为废弃物，然而软骨却是硫酸软骨素的主要来源[4-5]。长期的临床应用证明，其具有降血脂、防止血管硬化、免疫调节、细胞黏附调节、抗炎、结肠癌的治疗[6]、抗口腔鳞状细胞癌[7]等多种生理活性和保健功能[8-10]。先前的研究多是以禽类[11-13]、鮟鱇鱼[14]、鲣鱼[15]及史氏鲟鱼[16]等为原料提取硫酸软骨素，而利用魟鱼提取硫酸软骨素的研究极少[17]，尤其尚鲜有对东海福建海域的中国魟提取工艺的报道。试验以中国魟为原料，利用双酶解法提取硫酸软骨素，应用均匀设计结合单因素试验对提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺，以缩短提取周期，提高魟鱼硫酸软骨素得率，减少环境污染和资源浪费，实现环境友好及低消耗，为魟鱼加工副产物的高值化利用提供理论依据，同时也为福建海洋资源开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

连江海域魟鱼骨架由福建省揽鲜农业有限公司提供，福建连江海域（北纬N 26°，东经E 119°）捕获，于-20 ℃冻存。

硫酸软骨素标准品、胰酶、碱性蛋白酶、氯化十六烷基吡啶（国药集团化学试剂有限公司）；活性炭（西陇科技股份有限公司）；白陶土（天津市光复精细化工研究所）。

V-5600型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；ZCZY-CS 8型摇床（上海知楚仪器有限）。

1.2 试验方法

1.2.1 魟鱼硫酸软骨素提取工艺流程

魟鱼蒸煮→剔除魟鱼肌肉，留软骨切碎烘干→称取2.5 g软骨→4%的NaOH浸泡，摇床（47.5 ℃，120 r/min）4 h→滤液加入一定量酶→摇床中酶解→85 ℃ 10 min酶灭活→弱酸滴定至pH 6.8～7.0→加入0.1 g/g白陶土和0.01 g/g的活性炭静止1 h→弱酸滴定至pH 6.0→加入一定量氯化钠→95%乙醇沉淀8 h→无水乙醇二次洗脱→60～65 ℃干燥→产物

1.2.2 CPC比浊法[18-19]测定魟鱼硫酸软骨素得率

标准品在105 ℃干燥至恒质量，精密称取25 mg，用2 mol/L的乙酸钠溶解后，定容至100 mL容量瓶中。取7个干净的试管，分别称取0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6和2.0 mL，分别加2.0 mol/L的乙酸钠溶液及0.2%氯化十六烷基吡啶（CPC），以蒸馏水定补至2.0 mL，充分振荡，室温放置1 h，以蒸馏水作空白，于680 nm测吸光度，绘制硫酸软骨素标准曲线的直线回归方程：Y=0.010 5X+0.004 8，R2=0.999 2，线性范围为0～50 μg/L。取1 mL 0.1 g/L样品溶液测吸光度，按式（1）计算硫酸软骨素得率。

式中：A表示标曲计算得到的X值；V表示向比色管中加入已配好样品溶液的体积，L；mT表示提取样品总质量，g；I表示待测魟鱼软骨质量，g；mD表示检测样品称取量，g。

1.2.3 单因素试验

分别以一定量的氯化钠添加量、碱性蛋白酶与胰酶质量比、酶用量、酶解时间作为考察因素，按前述方法在一定的温度下处理一定时间提取魟鱼硫酸软骨素，考察各因素对硫酸软骨素得率的影响。试验结果为2次重复试验的平均值，平行3组。

1.2.3.1 氯化钠添加量的考察

固定碱性蛋白酶与胰酶质量比9︰1（g/g）、酶酶用量50 mg/g、酶解时间3 h，氯化钠添加量分别取0.8，1.2，1.6和2.0（g/g），提取魟鱼硫酸软骨素。

1.2.3.2 碱性蛋白酶与胰酶质量比的考察

固定氯化钠添加量1.2（g/g）、酶用量50 mg/g、酶解时间3 h，碱性蛋白酶与胰酶质量比分别取3︰7，1︰1，7︰3和9︰1（g/g），提取魟鱼硫酸软骨素。

1.2.3.3 酶用量的考察

固定氯化钠添加量1.2（g/g）、碱性蛋白酶与胰酶质量比7︰3（g/g）、酶解时间3 h，酶用量分别取30，40，50和60 mg/g，提取魟鱼硫酸软骨素。

1.2.3.4 酶解时间的考察

固定氯化钠添加量1.2（g/g）、碱性蛋白酶与胰酶质量比7︰3（g/g）、酶用量40 mg/g，酶解时间分别取0.5，1，2，3和4 h，提取魟鱼硫酸软骨素。

1.2.4 均匀设计试验

每份魟鱼软骨2.5 g，选择X1碱性蛋白酶与胰酶质量比、X2NaCl添加量、X3酶用量、X4酶解时间为影响因素，选用均匀试验设计表U10(104)。按1.2.2方法测定吸光度，计算魟鱼硫酸软骨素得率。3组平行试验取均值。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0进行单因素试验结果分析（ANVOA），并对U10混合水平均匀设计试验进行线性回归分析处理，采用Sigmaplot Graph作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 氯化钠添加量对魟鱼硫酸软骨素得率的影响

如图1所示，魟鱼硫酸软骨素得率随着氯化钠添加量的增加而增加，当氯化钠添加量达到1.2（g/g）时，得率达到最大值，为5.11%±0.059%。对得率进行统计分析，氯化钠添加量对提取得率有极显著影响（F3,8=1 111.329，p＜0.001）。这可能是不同的氯化钠添加量对所加入的酶产生了不同的影响，低浓度的Na+对酶的活性可能会产生抑制作用，随着离子浓度的逐渐增加，酶的活性由弱到强，当氯化钠添加量为1.2（g/g）时，达到其盐离子最适浓度因而活性最强[21]。当氯化钠添加量超过1.2（g/g）时，得率逐渐减小，原因是高浓度的Na+可能会导致酶蛋白失活，不利于酶活性的发挥，外部环境逐渐偏离其盐离子最适浓度，导致得率逐渐降低[21]。在该条件下研究氯化钠添加量单因素时，魟鱼硫酸软骨素得率均较低，可能原因是酶用量较少而酶解时间偏长，各因素均不是最优条件。因此，氯化钠添加量应选在0.8～1.7（g/g）之间。

图1 氯化钠添加量对魟鱼硫酸软骨素得率的影响

2.1.2 碱性蛋白酶与胰酶质量比对魟鱼硫酸软骨素得率

如图2所示，魟鱼硫酸软骨素得率随着碱性蛋白酶与胰蛋白酶质量比的增加而上升，当碱性蛋白酶与胰蛋白酶质量比达到7︰3（g/g）时得率达到最大值，为8.39%±0.031%，两者质量比在一定范围内能够提高得率。但是当质量比超过7︰3（g/g）时，得率呈下降趋势。对得率进行统计分析，碱性蛋白酶与胰酶质量比对硫酸软骨素得率有极显著影响（F3,8=1 433.512，p＜0.001）。这主要是因为硫酸软骨素在组织中多以蛋白多糖的形式存在，碱性蛋白酶提供碱性环境，其可破坏蛋白与多糖链的共价键结合，将硫酸软骨素和蛋白释放出来[20]，同时使得蛋白变性，为胰蛋白酶提供作用底物，因为胰蛋白酶只水解变性蛋白[17]，而碱性蛋白酶量增加更有利于提高魟鱼硫酸软骨素的得率。当碱性蛋白酶占比超过7︰3（g/g）后，胰蛋白酶占比降低，得率也随之减少。因此，碱性蛋白酶与胰酶质量比应在1︰1～9︰1（g/g）之间。

2.1.3 酶用量对魟鱼硫酸软骨素得率的影响

如图3所示，魟鱼硫酸软骨素得率随着酶用量的增加先上升后下降，至40 mg/g时得率达到最大值，为9.11%±0.025%。对得率进行统计分析，酶用量对得率有极显著影响（F3,8=331.857，p＜0.001）。这是因为酶用量较低时，酶与底物反应不充分，限制了蛋白质的水解程度，酶用量逐渐增加，所有的底物蛋白都能与酶充分反应，使得以蛋白多糖形式存在的硫酸软骨素被完全释放出，提高了得率[22]。当酶用量达到40 mg/g时，底物浓度正好饱和，得率最高。当酶用量从40 mg/g增至60 mg/g时，会导致酶作为一种未被水解的杂蛋白在提取液中残留[22-23]，同时酶用量过高也会出现反馈抑制[24]，从而降低硫酸软骨素的得率。因此，加酶量选择30～50 mg/g之间为宜。

图2 碱性蛋白酶与胰酶质量比对魟鱼硫酸软骨素得率的影响

图3 酶用量比对魟鱼硫酸软骨素得率的影响

2.1.4 酶解时间对魟鱼硫酸软骨素得率的影响

如图4所示，随着酶解时间的延长，魟鱼硫酸软骨素的得率逐渐提高，至1 h时得率最大，为10.04%±0.102%。对得率进行统计分析，酶解时间对得率有极显著影响（F4,10=1 488.783，p＜0.001）。原因是随着酶解时间的延长，蛋白酶与底物蛋白作用更加充分，蛋白与多糖被分离，魟鱼软骨细胞组织内水溶性硫酸软骨素更容易溶出，得率随之提高；之后，得率随着酶解时间的继续延长而逐渐降低，这是由于随着酶解时间的继续延长，酶的活性逐渐降低，一般酶解时间不易超过4 h[17]。因此，酶解时间在0.5～2 h之间为宜。

图4 酶解时间对魟鱼硫酸软骨素得率的影响

2.2 均匀设计法试验

运用SPSS 17.0对上述结果（表1）绘制矩阵散点图（图5）及简单散点图，结果表明4个因素之间无明显相关关系，但两两因素间具有线性关系，因此，作进入回归分析，得到四元一次回归方程：Y=10.98+0.163X1+1.684X2+0.04X3-0.030X4，F(4,5)=13.169，p=0.007＜0.05（表2），表明回归方程在α=0.05水平上有显著意义，说明线性关系可信[25]。复相关系数r=0.956，表明4个因素和提取率之间存在极显著的线性关系。R2=0.913 3，较高，说明二次多项式回归效果好，所得方程可以较好地拟合硫酸软骨素得率提取过程，方程有意义[26]。各因素的容差均大于0.1，说明各因素间不存在多重共线性问题。各因素中NaCl添加量（p=0.011 3＜0.05）、酶用量（p=0.006 1＜0.05）、酶解时间（p=0.006 1＜0.05）对硫酸软骨素得率的影响显著，碱性蛋白酶与胰酶质量比对得率的影响不显著，p=0.016 7＞0.05（表2）。由于X1、X2、X3、X4的变化范围不同（X1为1～5.5 g·g-1，X2为0.8～1.7 g·g-1、X3为20～65 mg·g-1、X4为40～85 min），直接用偏回归系数的大小说明各自因素的重要性不够科学，而运用标准化偏回归系数更为合适[27]，影响大小依次为：酶添加量＞NaCl添加量酶添加量＞酶解时间＞碱性蛋白酶与胰酶质量比。对回归方程进行优化处理，剔除不显著因素，得到最终方程：Y=11.371+1.412X2+0.042X3-0.025X4。用Microsoft Office对优化方程进行规划求解，并结合上述均匀性试验最大值、经济性原则及实际经验，最终确定魟鱼硫酸软骨素最佳酶解提取工艺：碱性蛋白酶与胰酶质量比2︰1（g/g）、NaCl添加量1.7（g/g）、酶用量65 mg/g、酶解时间40 min。此时模型预测理论得率为15.501%。而在单因素试验中，各因素的最佳条件分别为碱性蛋白酶与胰酶质量比7︰3（g/g）、氯化钠添加量1.2（g/g）、酶用量40 mg/g、酶解时间1 h，可能是因为在单因素试验中，影响得率的只有一个因素的不同水平，但在均匀设计试验中，各个因素之间存在相互作用和影响，所以酶解提取工艺参数在均匀设计试验和单因素试验中得到的不一定相同[28]。

表1 均匀设计试验安排及结果

图5 矩形散点图

表2 方差分析表

2.3 最佳工艺的确定和验证

按照碱性蛋白酶与胰酶质量比2︰1（g/g）、NaCl添加量1.7（g/g）、酶用量65 mg/g、酶解时间40 min的条件，进行3次验证试验，魟鱼硫酸软骨素得率为5.35%±0.5%，与模型预测值偏差不足0.98%。较早前的提取方法[17]，魟鱼硫酸软骨素得率提高将近2倍，酶解时间缩短近1/3。可知，试验所得魟鱼硫酸软骨素提取工艺简单可行，得率高。

3 结论

以单因素试验为基础，结合混合水平均匀试验结果，得到酶解法提取魟鱼硫酸软骨素的最佳工艺条件：碱性蛋白酶与胰酶质量比2︰1（g/g）、NaCl添加量1.7（g/g）、酶用量65 mg/g、酶解时间40 min，魟鱼硫酸软骨素得率为15.35%±0.5%。与早前方法相比，试验方法不仅大幅缩短了提取时间，还提高了硫酸软骨素的得率，为魟鱼的工业化生产提供思路，也为福建省海洋资源的开发利用提供参考。此次试验虽提供了一种魟鱼硫酸软骨素提取的高效方法，但该方法所得硫酸软骨素的纯化、结构鉴定及其生物活性还有待进一步研究。