5-羟色胺通过上调2B受体抑制放线菌素D诱导肝细胞凋亡初步实验研究

马丽霞 高玉娟 刘晓慧 张晶

肝细胞凋亡参与了多种急慢性肝脏疾病的发生、发展过程，如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积性肝病和肝脏缺血-再灌注损伤等，是肝细胞损伤的重要机制之一[1-2]。体内和体外实验发现， Fas配体、肿瘤坏死因子-ɑ、放线菌D(actinomycin D，AcD)、干扰素、四氯化碳等常见的肝毒性药物可诱导肝细胞发生凋亡[3]。随着研究的深入，相继发现N-乙酰半胱氨酸、蛋白水解酶抑制剂、角质细胞生长因子等，可抑制肝细胞凋亡的发生[4-5]，但其作用机制尚未完全阐明，且临床应用还很少。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作为一种神经递质的小单胺分子，对肝脏的病理生理起着至关重要的作用，它可以促进多种啮齿动物部分肝切除术后的肝脏再生，促进缺血/再灌注损伤后的肝组织修复[6，7]。研究发现，5-HT还能够通过抑制小鼠肝细胞凋亡，改善对乙酰氨基酚诱导的肝损伤[8]。肝细胞损伤与细胞凋亡的关系非常密切。到目前为止，5-HT在AcD诱导的肝细胞凋亡过程中的作用尚不清楚。本研究探讨5-HT在AcD诱导的肝细胞凋亡过程中的作用及其可能的机制，为临床应用5-HT制剂治疗肝脏疾病提供依据。

材料与方法

一、细胞、材料和试剂

人肝癌细胞系HepG2细胞和正常细胞系7702细胞(美国ATCC公司)；DMEM培养基、1640培养基和胎牛血清(美国Hyclone公司)，AcD、5-HT、MTT工作液(美国Sigma公司)，5-HT 2A受体激动剂2，5-二甲氧基4一碘苯基丙烷(2，5-dimethoxy 4-iodophenyl- 2-aminopropane，DOI)、5-HT 2B受体激动剂α-甲基血清素马来酸盐(α-Methylser otoninmal- eate salt，M110)、5-HT 2B受体拮抗剂N-1-甲基-5-吲哚基-5-三唑基(N-1-methyl-5-indolyl -5-isothazolyl urea，SB204)(美国Sigma公司)；Annexin V-FITC流式检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；TUNEL试剂盒(德国罗氏公司)；抗肌动蛋白(β-actin)(立陶宛Fermentas公司)；PVDF膜(美国Bio-Rad公司)；兔抗人蛋白水解酶3(proteolytic enzymes 3，caspase3)单克隆抗体、DAPI荧光染料(美国Abcam公司)；兔抗人丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，AKT)单克隆抗体、兔抗人磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphorylation serine/threonine protein kinase， p-AKT)单克隆抗体(美国Epitomics公司)。

二、细胞培养及药物处理

含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HepG2细胞，10%胎牛血清的1640培养基培养7702细胞，分别在37℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养。选取一部分对数期的两种细胞，即传代后细胞密度生长至80 %左右时，Hank′s液洗涤细胞，加入少量0.25%胰酶消化1～2 min，分别加入各自培养基轻柔吹打成单个，细胞计数后取1.5×105个细胞铺种于6孔板中，培养体系为2 mL，孵育24 h细胞贴壁生长后，弃去原培养基，分别换为2 mL无血清培养基，各加入25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD，每组3个复孔，分别孵育24 h后收集细胞为第1.1部分。将另一部分37℃、体积分数为0.05的CO2条件下孵育的处于对数生长期的HepG2细胞消化吹散后细计数，取1.5×105个细胞铺于6孔板内，孵育过夜待细胞贴壁后改为无血清培养，每孔加入50 ng/mL AcD预处理30 min后，分别给予100 μmol 5-HT、100 μmol 5-HT 2B受体激动剂M110、100 μmol 5-HT 2A受体激动剂DOI、100 μmol 5-HT 2B受体拮抗剂SB204+100 μmol 5-HT，每组6个复孔，各孵育24 h后收集细胞为第1.2部分。

三、细胞凋亡检测

采用AnnexinV-FITC/PI流式细胞术检测，取1.1和1.2部分收集的各组细胞置于15 mL离心管，1 000 r/min(r=13.5 cm)离心5 min，弃上清；用4℃预冷的1×PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后，1 000 r/min(r=13.5cm)离心5 min；弃上清，用1×PBS重悬细胞并计数；取1.5×105个重悬细胞，放入新的流式管中，1 000 r/min(r=13.5 cm)离心5 min，弃上清；每管加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10 min；1 000 r/min(r=13.5 cm)离心5 min，弃上清，每管加入190 μL Annexin V-FITC结合液，再加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。上流式细胞仪检测：每实验组收集细胞1.5×105个，不足1.5×105个细胞组收集全部，FL1为FITC，FL2为PI，上机检测。

四、细胞凋亡形态学检测

采用TUNEL法，取1.1部分收集的各组细胞分别加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，尽量使细胞单层吸附到载玻片上，甲醛固定30 min，PBS浸洗2次，每次5 min。将吸附细胞的载玻片在0.2% Triton X-100中处理15 min，PBS浸洗2次。参照TUNEL试剂盒说明书制备TUNEL反应混合液，将TdT与荧光素标记的dUTP液按1∶10比例混匀，将反应液滴加适量于细胞上，37℃孵育1 h，加入50 μL converter-POD于标本上，加盖玻片避光后37℃反应30 min，使用二氨基联苯胺(DAB)将TUNEL阳性细胞染色并用苏木精复染色，显微镜下观察结果并拍照记录。

五、细胞存活率检测

采用MTT法，①取一部分处于对数期的HepG2和7702细胞吹打成单个后细胞计数，取5×103个细胞铺种于96孔板中，培养体系为200 μL，孵育24 h细胞贴壁生长后，弃去原培养基，分别换为200 μL无血清DMEM培养基和1640培养基，各加入25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD，每组3个复孔，分别孵育24 h。②取另一部分处于对数生长期的HepG2细胞消化吹散后细计数，5×103个细胞铺种于96孔板中，培孵育过夜待细胞贴壁后改为无血清培养，每孔加入50 ng/mL AcD预处理30 min后，分别给予100 μmol 5-HT 、100 μmol 5-HT 2B受体激动剂M110、100 μmol 5-HT 2A受体激动剂DOI、100 μmol 5-HT 2B受体拮抗剂SB204+100 μmol 5-HT，每组6个复孔，各孵育24 h。向以上两部分的细胞中各加入20 μL 5 mg /mL MTT，37℃温育5 h。弃上清，每孔加入DMSO溶液150 μL溶解沉淀，振荡器振荡10 min，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光值并记录结果。

六、细胞蛋白表达检测

采用蛋白质印迹法，取1.2部分收集的各组细胞，根据蛋白提取试剂盒说明书步骤提取蛋白，消化、离心收集处理，加入裂解液于4℃冷库摇床上裂解20 min，12 000 r/min (r=13.5 cm)4℃离心20 min，提取上清液即为蛋白溶液。BCA法进行蛋白定量，将蛋白浓度调节到8 μg/μL，分装后-80℃保存，避免反复冻融。配置SDS-PAGE凝胶，分离蛋白后转至PVDF膜上，用相应的第一抗体孵育(兔抗人caspase3单抗、AKT单抗、p-AKT单抗比例均为1∶1 000，β-actin比例为1∶2 000)，TBST洗涤后用再加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶5000)，化学发光试剂(ECL)显影，以β-actin为内参照。

七、统计学分析

结 果

一、不同浓度AcD处理HepG2细胞和7702细胞凋亡率和存活率的比较

Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测结果显示不同浓度AcD分别处理HepG2细胞和7702细胞24 h后均可诱导细胞凋亡率增加，且细胞凋亡率均随着AcD浓度的升高而升高，其中50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD组细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)。见表1。 MTT检测结果显示两种细胞存活率均随着AcD浓度的升高而降低，其中50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL AcD组细胞存活率显著低于对照组(P<0.05)，见表2。TUNEL法测定细胞DNA的片段化，结果可见50 ng/mL AcD组相比无血清对照组有更多的DNA片段化(图1)，表明细胞凋亡增加。因此，研究表明，AcD能够以浓度依赖的方式促进HepG2和7702细胞的凋亡。

表1 不同浓度AcD处理HepG2细胞和7702细胞凋亡率的比较(±s)

注：统计值为各组与无血清对照组相比较

表2 不同浓度AcD处理HepG2细胞和7702细胞存活率的比较(±s)

注：统计值为各组与无血清对照组相比较

图1TUNEL法检测HepG2细胞的凋亡 A 无血清对照组 B 50 ng/mL AcD处理组

二、5-HT和5-HT 2B受体激动剂抑制AcD诱导的HepG2细胞凋亡

Annexin V-FITC/PI流式细胞术结果显示，50 ng/mL AcD处理HepG2细胞24 h后的凋亡率为31.96% ±2.13%，5-HT可使50 ng/mL AcD预处理HepG2细胞的凋亡率降至10.24% ±2.59%(t=1.62，P<0.05)，5-HT 2B受体激动剂M110与5-HT作用相似，使凋亡率降至8.41%±0.96%(t=1.75，P<0.05)，而5-HT 2A受体激动剂DOI使细胞凋亡率上升至32.46%±0.41%(t=1.23，P>0.05)。反之，5-HT 2B受体拮抗剂SB204能拮抗5-HT的抗凋亡作用，其凋亡率为25.92%±1.33%(t=1.45，P>0.05)。MTT法检测以上各组细胞存活率，结果发现单用50 ng/mL AcD处理HepG2细胞24 h后细胞存活率为75.0%±2.96%，而5-HT、5-HT 2B受体激动剂M110使细胞存活率分别升至88.10%±3.16%(t=1.33，P<0.05)、84.97%±3.22%(t=1.28，P<0.05)，而DOI组、5-HT+SB204组分别为70.95%±4.11%(t=1.33，P>0.05)、72.10%±2.8%(t=1.29，P>0.05)。蛋白质印迹法检测活化caspase3的表达，结果显示50 ng/mL AcD处理HepG2细胞后活化caspase3的表达较无血清对照组明显增多(t=1.45，P<0.05)，以单用AcD组为对照，5-HT和5-HT 2B受体激动剂M110使HepG2细胞活化caspase3的表达明显减少(5-HT 组t=0.45，M110组t=0.67，均P<0.05)，而加入5-HT 2A受体激动剂DOI、5-HT 2B受体拮抗剂SB204+ 5-HT的活化caspase3表达均较AcD组差异无统计学意义(DOI组t=0.22，SB204组t=0.35，P>0.05)(图2)。以上结果均提示100 μmol 5-HT及100 μmol 5-HT 2B受体激动剂M110均能够抑制AcD诱导的HepG2细胞凋亡，提高细胞存活率。

注：1.无血清对照组；2. AcD组；3. AcD+5-HT组；4. AcD + M110组；5. AcD+DOI组；6. AcD+5-HT+SB204组

图2蛋白质印迹法检测不同处理组HepG2细胞活化caspase3的表达

三、5-HT抗凋亡作用的信号传导通路

蛋白质印迹法检测不同处理组的AKT和p-AKT蛋白表达，结果显示各组的AKT蛋白表达总量相当，和单用AcD组相比，5-HT组和5-HT 2B受体激动剂M110组p-AKT蛋白表达增多(t=0.26，P<0.05)，而5-HT 2B受体拮抗剂SB204组p-AKT蛋白表达量较单用AcD组差异无统计学意义(t=0.11，P>0.05)，以上提示5-HT能够促进AKT磷酸化，并且5-HT引起的AKT磷酸化可被5-HT 2B受体拮抗剂SB204所拮抗，提示该途径可能是通过5-HT 2B受体所介导(图3)。

注：1.无血清对照组；2. AcD组；3. AcD+5-HT组；4. AcD + M110组；5. AcD+DOI组；6. AcD+5-HT+SB204组

图3蛋白质印迹法检测不同处理组AKT和p-AKT蛋白的表达

讨 论

本研究发现，5-HT能够抑制AcD诱导的肝细胞凋亡，5-HT和5-HT 2B受体激动剂M110可以促进肝细胞AKT的磷酸化，并且此作用可以被5-HT 2B受体拮抗剂SB204所拮抗。表明5-HT很有可能通过5-HT 2B受体介导激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT信号通路，使肝细胞凋亡减少。

研究表明，肝炎(病毒性、内毒素性、药物性)、肝缺血再灌注损伤、肝硬化、肝肿瘤等肝脏疾病均与肝细胞凋亡有关，抑制肝细胞凋亡可以改善这些肝脏疾病[2]。随着研究的深入，现已发现多种凋亡抑制剂可保护肝细胞。Wang等[9]发现，生长激素可以抑制小鼠肝细胞凋亡。N-乙酰基-血清素可通过线粒体途径保护H2O2诱导的HepG2细胞凋亡，N-乙酰半胱氨酸可抑制线粒体膜磷脂酶的活性从而抑制肝细胞的凋亡[10，11]。但这些药物发挥抗凋亡作用的具体分子机制尚不十分明确，目前许多药物研究还停留在实验室阶段。

5-HT是一种具有多种生理功能的物质，除了作为神经递质以外，还参与血管收缩、炎症反应、血液凝固等多种生理反应。在肝脏中，5-HT参与了肝纤维化、肝脏血流调节、肝细胞和胆管细胞的再生、肝细胞凋亡等多种生理过程[6-7]。近年来，5-HT作为一种新的抗凋亡因子被越来越多的用于各种体外的研究，Soll等[12]发现，5-HT保护血清剥夺引起的HepG2细胞的自噬。

5-HT受体共有7种，含14个亚型，其中5-HT2A、2B受体参与细胞增殖和凋亡。研究证实，肝细胞、窦状内皮细胞表达5-HT 2A、2B受体，胆管细胞表达5-HT 2B受体[13]，另有研究报道，5-HT 2受体阻断剂也能够抑制镉诱导的大鼠肝组织凋亡[14]。本研究发现，5-HT能够使AcD诱导的肝细胞凋亡率降低，存活率增加，减少caspase3的活化，起到抗肝细胞凋亡的作用。为了进一步确定受体的类型，研究了5-HT 2A受体激动剂DOI，5- HT 2B受体激动剂M110，结果显示5-HT 2B受体激动剂M110同样也可以显著抑制AcD诱导的肝细胞凋亡，而5-HT 2A受体激动剂DOI可增加AcD诱导的肝细胞凋亡，因此推断5-HT抗肝细胞凋亡作用可能与5-HT 2B受体有关，本研究进一步通过5-HT 2B受体拮抗剂SB204能够对抗5-HT的抑制凋亡作用来证实这一结论。

目前公认的肝细胞凋亡信号通路主要包括细胞膜死亡受体通路和细胞色素C释放、caspase激活的线粒体通路，即外源性途径和内源性途径[15-16]。在众多凋亡信号通路中，PI3K信号通路参与增殖、分化和凋亡等多种细胞功能的调节，PI3K/AKT信号传导通路在抗凋亡机制中发挥重要作用也已为诸多实验所证实[17-18]。PI3K激活后，质膜上产生第二信使3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatid- ylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT结合导致AKT的活化。AKT又称为蛋白激酶B(protein knlase，BPKB)，是一种相对分子质量为60 000的丝氨酸/苏氨酸激酶，其作为PI3K的下游靶蛋白是一种多功能调节因子，激活后能直接磷酸化多种转录因子，如激活κB激酶、Bcl-2、Bax蛋白，或者抑制P53和caspase酶，通过调控这些转录因子，可以抑制凋亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达，起到抗凋亡作用。有研究发现，AcD诱导7702细胞凋亡的机制可能为其与PI3K/AKT通路上的某一蛋白结合，从而阻断AKT蛋白磷酸化及其活性[19]。为了进一步研究信号通路，检测了AKT和p-AKT的表达，结果发现，5-HT和5-HT 2B受体激动剂均可使AKT的磷酸化增加，这种作用也能被5-HT 2B受体拮抗剂所拮抗，提示5-HT的抗肝细胞凋亡作用很可能是通过5-HT 2B受体介导的，激活PI3K/AKT信号通路，从而使肝细胞凋亡减少，为临床应用5-HT制剂抑制肝细胞凋亡，保护肝细胞损伤提供新的依据。

本研究主要局限在于肝细胞系尤其是人肝癌细胞系HepG2细胞上的研究，缺乏在体实验的有力支持，尚需要动物实验进一步验证。