耐药基因blaNDM-1和mcr-1在肠道细菌中的研究进展

吕东月，汪照国，王 鑫

1928 年英国微生物学家弗莱明首次发现了世界上的第一种抗生素——青霉素[1]，这是人类历史上的重大发现。抗生素的发现使感染性疾病病死率大幅下降，同时感染性疾病并发症的发病率也显著降低。但是近年来，抗生素的频繁使用，出现并加剧了细菌耐药问题[2]，尤其是革兰氏阴性细菌中出现了多重耐药(Multidrug-resistant，MDR)细菌。另外，全球经济一体化在促进了各国之间的经济文化交流的同时，也加剧了细菌耐药问题。如今，细菌耐药性问题已经成为人类面对的一大公共卫生问题，对人类健康造成严重威胁，严格控制细菌耐药性的传播已迫在眉睫。

2014年4 月30 日，WHO首次发布关注全球抗生素耐药问题的报告，人类进入后抗生素时代。如今，细菌抗生素耐药性的发展和传播是全球卫生和食品安全的最大威胁之一[3]，引起了全世界的关注。2008年以来，各个国家相继发现碳青霉烯类药物耐药基因——blaNDM-1基因和多黏菌素耐药基因——mcr-1基因。

本文就blaNDM-1基因和mcr-1基因的发现、流行、耐药机制及检测方法等方面进行综述，以期能为严格控制抗生素的使用提供理论依据。

1 耐药基因blaNDM-1和mcr-1的发现

1.1 blaNDM-1基因的发现 blaNDM-1(New Delhi metallo-beta-lactamase 1，blaNDM-1)是一种质粒编码的全新的β-内酰胺酶。由于其是多药耐药和广谱耐药，因此又被称为“超级细菌”。2009年首次发现blaNDM-1基因[4]。2010年，中国研究者在鲍曼不动杆菌中发现了中国首例blaNDM-1基因[5]。

2008 年初，在印度新德里一家医院里，从一位男患者的尿液标本中分离出了一株肺炎克雷伯菌，该菌对多种抗生素，尤其是碳青霉烯类抗生素耐药。同年3月在该病人粪便标本中分离出了同样对碳青霉烯类抗生素耐药的大肠埃希菌。检测结果显示该病人体内分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中均存在一种新的金属β-内酰胺酶(Metallo-β-lactamase，MBL)，可转移B类β-内酰胺酶。与其他B类内酰胺酶(例如I MP和VI M)相似，而与A、C和D类β-内酰胺酶不同的是，blaNDM-1的活性位点存在锌离子，而不是丝氨酸残基[6-8]。由于该患者是在印度首都新德里接受治疗时被含该MBL的细菌感染，因此，研究者将其命名为新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase)，即blaNDM-1，同时以blaNDM-1来命名编码NDM-1的基因。blaNDM-1基因开放阅读框架为813个碱基，编码269个氨基酸，C-G的含量为57%，可以水解单环类以外的一大类β-内酰胺类抗生素。除了β-内酰胺类外，大多数blaNDM-1阳性细菌对其他类型的药物均具有广泛的耐药性，即几乎对替加环素和多黏菌素以外的所有抗生素耐药。blaNDM-1基因是从同一患者不同菌属细菌分离出来，这表明它可能是可转移的。由于其强耐药性和传播性，blaNDM-1迅速成为全球细菌耐药相关领域关注和研究的焦点之一。现在已发现的blaNDM-1基因的亚型有26种。其中，blaNDM-2基因是在鲍曼不动杆菌中获得的[9];blaNDM-3—blaNDM-7基因在大肠杆菌中被发现10-11];blaNDM-14和blaNDM-15基因是由我国首次发现并命名的[12]。

1.2 mcr-1基因的发现 多黏菌素类抗生素被称为对抗细菌感染的最后一道防线，常常作为饲料添加剂或治疗药应用于畜牧业。多黏菌素类抗生素的广泛使用促使了多黏菌素耐药问题的出现。

2015 年，中国学者在一株猪源性大肠埃希菌SHP45中首次发现了可以让细菌对多黏菌素产生抗药性的新基因——mcr-1(Mobile Colistin Resistance-1)[13]。其开放阅读框为1 626 bp，G-C含量49%，位于Inc Hl2型质粒上。mcr-1基因是质粒介导的黏菌素耐药基因，可介导肠杆菌科细菌对多粘菌素类药物产生耐药性并可通过质粒进行水平转移。正是因为mcr-1可水平转移的特性，使耐药菌广泛快速传播，黏菌素耐药率升高。另外，研究表明mcr-1基因可以与其他耐药基因共存。这一现象，进一步加剧了细菌耐药性对人类健康的威胁。随着研究的深入，mcr-1的亚型mcr-2—mcr-9相继被发现。Xavier等人发现了多黏菌素耐药基因mcr-2，开放阅读框为1 617 bp，与mcr-1的同源性为76.75%[14-15];Yin等人报道了mcr-3，开放阅读框为162 bp，其与mcr-1和mcr-2分别有45.0%和47.0%的核酸一致性[16];Carattoli A等人在意大利屠宰场的一头猪中分离到的鼠伤寒沙门氏菌的单相变体并从中发现了mcr-4基因，其与mcr-1、mcr-2和mcr-3分别具有34.0%、35.0%和49.0%的氨基酸序列同一性[17];Maria Borowiak等人在副伤寒沙门氏菌分离物中鉴定到了新的磷酸乙醇胺转移酶基因，并将其命名为mcr-5，其开放阅读框为1 644 bp[18]。

2 耐药基因bla NDM-1和mcr-1的流行情况

2.1 blaNDM-1基因的流行情况 近年来，大多数国家和地区相继报道了blaNDM-1基因。blaNDM-1耐药性在全球范围内呈散发的趋势，而且病例之间没有流行病学联系。2008－2009年在英国、印度、巴基斯坦和孟加拉国进行的一项调查中，发现180余例blaNDM-1基因阳性菌，以肺炎克雷伯菌和大肠杆菌为主。2010年2月至2010年7月，印度一家医院的blaNDM-1流行率为6.9%[19-20]，在巴基斯坦一家医院中，有18.5%的住院病人和门诊患者的肠道菌群中携带blaNDM-1细菌[21]。另外，在医院的医疗环境及外环境(污水、自来水)中也发现携带blaNDM-1的革兰氏阴性菌[22]。全球范围内，除了存在于肺炎克雷伯菌和大肠杆菌外，blaNDM-1还存在于不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌等大部分革兰氏阴性菌中。目前，除了非洲中部、南美洲西部个别国家没有报道，其他国家和地区均呈blaNDM-1耐药基因全球流行蔓延的趋势[23]。

我国blaNDM-1阳性病例存在明显的地区、年龄及性别差异。截至2015年已经有25个省市(含港澳台地区)报道了blaNDM-1阳性菌株。其中，东南部沿海地区blaNDM-1阳性病例分布较多，广东地区报道的阳性病例为109例，占39.49%，明显多于其他地区[24]。研究表明，blaNDM-1阳性菌的感染者中，男性明显多于女性，年龄分布主要集中在10岁以下和60～80岁之间。这表明，基础体质和免疫力较差的人群属于产blaNDM-1细菌感染的易感人群。此外，blaNDM-1基因还存在于伴生动物中，尤其是候鸟。候鸟的迁徙使blaNDM-1基因的水平转移成为可能，进一步促进了blaNDM-1的全球蔓延。

2.2 mcr-1基因的流行情况 多黏菌素长期用于畜牧业中，主要是多黏菌素B和多黏菌素E，各个国家一直将其用于禽畜的饲料添加剂以及疾病的预防和治疗。在全球范围内生产多黏菌素E的国家中，亚洲的国家占73%。多黏菌素在畜牧业的广泛应用，促进了mcr-1耐药基因的传播。从2015年中国报道mcr-1基因后，美国、英国、加拿大、泰国、丹麦等35个国家也相继发现了mcr-1基因。2000－2004年，在日本的健康动物中，mcr-1阳性的大肠埃希菌占0.4%[25];2009-2015年，法国、德国和越南分别在猪中检出携带mcr-1的大肠埃希菌，阳性率分别为0.5%[26]、2.3%[27]和37.5%[28];2014年，在埃及的奶牛中，携带mcr-1基因的大肠埃希菌的阳性率为2.6%[29];2016年，在中国广东的猫和犬中，携带mcr-1的大肠埃希菌的阳性率分别为14.3%、10.3%[30]。中国上海的一项2006-2016年回顾性研究中，在12 053株沙门氏菌中，有37株是mcr-1阳性，而且2015年后，阳性率呈上升趋势[31]。总体来看，部分国家动物源菌株中的mcr-1携带率比较低(＜5%)，而中国、越南等国家的mcr-1基因的阳性率较高。

除了在猪、鸡、犬等动物体内发现有mcr-1基因外，在动物性食物、水、蔬菜、医院废水、患者的痰液、血液、尿液以及伤口分泌物中也检出mcr-1基因。一项研究表明，2011－2014年间，在中国的523份生肉标本中，mcr-1阳性率为15%，在804份动物体内检出mcr-1阳性率为21%，在1 322份感染患者体内，mcr-1阳性率为1%[13]。

3 耐药基因bla NDM-1和mcr-1的耐药机制

3.1 blaNDM-1基因的耐药机制 blaNDM-1基因是一种新发现的B类金属β-内酰胺酶，对该基因进行同源性分析发现，blaNDM-1基因与 VI M 基因较为相似[32]。blaNDM-1基因对除了替加环素和多黏菌素以外的多种抗生素均耐药，尤其是碳青霉烯类抗生素。blaNDM-1的活性部位为金属离子，即锌离子，必须依赖锌离子的存在才能发挥催化活性，锌离子对亚胺培南、厄他培南等常见碳青霉烯类抗生素有很强的水解活性，对其产生耐药性。blaNDM-1基因位于一个耐药基因元件中，包含Ⅰ类整合子，其上游是基因组DNA，下游还有插入序列IS26和Tn3转座基因。整合子、转座子和插入序列是基因转移的基本元件[33]，因此，耐药基因blaNDM-1可以通过质粒的转移，转移到敏感菌上，使之成为耐药菌，从而实现了blaNDM-1基因的跨种属传播。

3.2 mcr-1基因的耐药机制 mcr-1位于多种类型的可接合质粒上，可以在不同质粒与不同菌属间传播。mcr-1基因主要位于lnc X4和Inc Hl2型质粒上[34]，Inc Hl2、Incl2和l nc P是mcr-1基因的主要质粒[35]。此外，该基因可以与其他耐药基因同时存在，这会加速mcr-1的转移和耐药性的传播。Liu等人发现mcr-1能够降低黏菌素的药效[13]，对黏菌素产生耐药性。mcr-1是磷酸乙醇胺转移酶家族的成员，mcr-1蛋白通过5个跨膜螺旋(TMHS)锚定在细菌的细胞质膜的周质中;细菌的脂多糖在胞浆中被合成后，通过ABC转运蛋白MSBA翻转到内膜的外表面，然后进入周质中。由于mcr-1具有磷酸乙醇胺转移酶的活性，脂多糖中的脂质A在周质中被磷酸乙醇胺共价修饰，二元调控系统(TCSs)被激活，使脂质A结构改变，导致细菌细胞外膜与多黏菌素的亲和性下降，从而导致对多黏菌素耐药性的产生。在mcr-1基因中，69%的基因结构中存在插入序列ISApl1，ISApll是一个高度活跃的元素，它的运动可能对宿主细胞有害[36]。这个可移动元件的整合会使mcr-1基因容易被其他质粒捕获，从而实现mcr-1基因在不同菌种、不同地区之间传播。研究表明，mcr-1阳性菌株不仅可以水平传播，也存在克隆传播，具有遗传多样性[37]。

4 耐药基因bla NDM-1和mcr-1的检测方法

4.1 blaNDM-1基因的检测方法 由于产blaNDM-1细菌感染的临床表现与敏感菌感染没有差异，临床诊断比较困难[38]，因此，blaNDM-1基因的检测常常依赖于实验室检测。产blaNDM-1细菌的实验室诊断包括筛查、表型确认以及分子确证实验3个步骤。

4.1.1 表型筛查试验 在细菌药物敏感性测定中，以美洛培南或亚胺培南纸片法(K-B法)或者最低抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查，如果达到以下标准，应怀疑细菌产碳青霉烯酶，需要进行表型确认。厄他培南特异性较低，不推荐用于筛查试验。

4.1.1.1 K-B法 美洛培南(10μg纸片)抑菌圈直径≤23 mm或亚胺培南(10μg纸片)抑菌圈直径≤21 mm时，需要进行表型确认。

4.1.1.2 最低抑菌浓度(MIC) 测定美洛培南MIC≥0.5 mg/L时，需要进行表型确认;对大肠埃细菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属，亚胺培南MIC≥2 mg/L时，可进行表型确认试验。

4.1.2 表型确认试验 采用亚胺培南＋EDTA复合纸片或者E纸条，进行KB法药敏试验或者MIC测定，如果复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值≥5 mm，或单药与复合制剂的MIC比值≥8时，判定产金属β-内酰胺酶，需用分子生物学技术进行酶型确认。

4.1.3 酶型分子确认试验 采用blaNDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确认菌株是否携带blaNDM-1基因。

4.2 mcr-1基因的检测方法 mcr-1基因的检测方法有药敏纸片扩散法(disk diff usion)、浓度梯度法(E-test)和自动化系统(auto mated systems)以及多黏菌素NP快速测试法(Rapid Polymyxin NP test)。研究表明，多粘菌素NP快速测试法对mcr-1基因的检测效率更高，效果更好[39]。另外，Nor dmann P等人探测细菌细胞在多黏菌素存在时的葡萄糖代谢，来观察其生长情况，进而鉴定其耐药性[40]。Chabou S等人用Taq Man (R)探针进行快速实时PCR检测，其特异性和灵敏度可达到100%[41]。

近年来，细菌耐药问题已经向多重耐药和广谱耐药方向发展，耐药问题已成为人类重要的公共卫生问题，对人类、家畜家禽、环境等造成巨大的威胁。blaNDM-1基因和mcr-1基因的出现，尤其是其可水平转移的特点，更新了人们的观念，引起了全球的关注。目前，耐药基因blaNDM-1和mcr-1还未形成严重的流行。因此，只要人们及时采取措施，合理有效的使用抗生素，就能严格控制耐药基因的传播，扭转细菌耐药问题的严重形势。