靶向寄生虫的核酸适配体应用研究进展

杨 帆，李石柱，秦志强

尽管寄生虫病的防治已取得了显著成效，但欠发达国家仍有数以亿计的人正遭受寄生虫病的危害。在缺乏有效疫苗的情况下，寄生虫病的防治主要依赖于检测和治疗以及媒介的控制[1]。目前，诊断寄生虫感染的金标准主要基于显微镜检查的病原学方法，但病原检测敏感性较低、容易漏检、费事费力且对操作人员技术要求较高，检测结果易受制片质量和主观影响。因此，多年来人们一直探寻敏感性较高的免疫学和核酸检测方法来应用于寄生虫感染的临床诊治以及流行病学筛检。此外，传统的抗寄生虫药物种类较为单一，部分地区的寄生虫感染者也逐渐出现了抗药性，因此亟需寻找新的药物来控制寄生虫感染。核酸适配体作为一种稳定、有效、经济的生物识别元件，有望发展用于寄生虫感染的检测试剂和治疗药物。本文综述了靶向疟原虫(Plasmodiu m)、锥虫(Trypanosome)、利什曼原虫(Leishmania)等寄生虫的核酸适配体应用研究，旨在为寄生虫感染的检测和防治提供借鉴。

1 核酸适配体

核酸适配体是一类长度为20～100个核苷酸的单链DNA或RNA分子，可通过其独特的三维结构与靶分子特异性结合，平衡解离常数(equilibriu m dissociation constants，Kd)介于纳摩尔和皮摩尔范围，具有与抗体相媲美的高亲和力和特异性，被称为“化学抗体”[2]。此外，核酸适配体可于室温下生产和储存，易于实现商业化应用，可替代抗体成为诊断和治疗的特定标记物[3]。目前，核酸适配体已被应用于新药开发、诊断试剂、药物递送剂、生物成像剂等生命科学、医学、环境和食品等领域[4]。

核酸适配体一词最早由Ellington和Szostak[5]于1990年提出，用于描述特异性结合多种有机染料的RNA分子。同年，Tuerk和Gold[6]开发了指数富集的配体系统进化(systematic evol ution of ligands by exponential enrich ment，SELEX)技术，用于体外筛选特异性结合噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA。SELEX是对包含4n个独立核酸序列的随机文库进行迭代选择，以获取高亲和力和特异性结合靶标(候选核酸)的过程。SELEX主要包含核酸文库与靶标分子孵育结合、富集的复合物分离与洗脱和结合序列的PCR扩增等步骤，通过不断提高筛选条件的严格性，直至获得高亲和力结合序列。SELEX各轮次结束后，将富集的核酸序列克隆到合适载体中，进行测序和鉴定[7]。迄今为止，基于SELEX方法，针对小分子、蛋白、细胞、病毒、细菌、寄生虫等多种靶标，筛选获得了数千个具有高亲和力和特异性的核酸适配体[8-9]。理论上，可以针对无限范围的靶标选择核酸适配体，包括不能被抗体识别的有毒和非免疫原性分子。与抗体(5～15 k Da、直径约15 n m)相比，核酸适配体具有较低的相对分子质量(6～30 k Da)和较小尺寸(直径约2 n m)，可结合较小的靶标或某些抗体无法抵达的隐藏结合域。此外，核酸适配体不存在免疫原性的限制[10]。核酸适配体需要在血管系统中存在足够长的时间，顺利到达靶标所在位置，通过与靶标的相互作用，发挥疾病检测、治疗等作用[11-12]。截至目前，通过筛选获得的核酸适配体中，哌加他尼(Macugen)已获得了美国食品与药品管理局的批准，可应用于临床，作为聚乙二醇化修饰的RNA适配体，Macugen可用于治疗黄斑变性和糖尿病黄斑水肿[13]。

2 靶向寄生虫的核酸适配体

目前，针对寄生虫感染的核酸适配体开发策略主要有:①靶向宿主细胞基质受体，阻碍寄生虫与宿主间的相互作用;② 抑制寄生虫细胞蛋白功能;③攻击寄生虫细胞内血红素或干扰细胞内RNA转运;④ 靶向寄生虫细胞蛋白保守结构域，用于寄生虫感染诊断和鉴定，或充当抗寄生虫药物的传送载体。

2.1 靶向疟原虫的核酸适配体 疟疾是一种重要的热带病。2017年全球约有2.19亿疟疾病例，死亡人数约43.5万[14]。在已知感染人类的5个疟原虫虫种中，恶性疟原虫(P.f alciparum)和间日疟原虫(P.vivax)最为常见。恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(P.f alciparum erythrocyte me mbrane protein 1，Pf EMP1)在寄生虫致病性中发挥重要作用，可使被感染红细胞黏附在血管内皮层，未感染红细胞形成“玫瑰花结”。“玫瑰花结”为毒力相关表型，由Pf EMP1的N末端达菲结合样结构域(N-ter minal duff y-binding-like domain 1α，DBL1α)介导形成。因此，DBL1α有望成为治疗疟疾新药和疫苗的候选靶标，Barfod等[15]通过8轮SELEX从体外筛选获了3个与Pf EMP1中半保守表位DBL1α结合的RNA适配体b02、d12和e05，具有定位受感染红细胞的潜力，387 n mol/L的RNA适配体对“玫瑰花结”的破坏能力为100%。另外，有研究表明，阻断恶性疟原虫的血红素降解，可以有效抑制其生长发育[16-17]。Niles等[18]以能与血红素卟啉结合的DNA适配体PS2 R和PS2 M Mod为研究对象，经3′-反向脱氧胸苷修饰后，导入至红细胞内，证明了血红素结合DNA适配体可抑制恶性疟原虫血红素的解毒途径。

Lee等[19]报告了针对间日疟原虫乳酸脱氢酶(P.vivax lactate dehydrogenase，Pv LDH)和恶性疟原虫乳酸脱氢酶(P.f alciparum lactate dehydrogenase，Pf LDH)的 DNA 适配体——p L1，Kd依次为(16.8±0.6)n mol/L、(38.7±1.3)n mol/L。在此基础上，该课题组开发了一种基于p L1和阳离子聚合物(聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚烯丙胺盐酸盐)介导的金纳米颗粒聚集的疟疾诊断生物传感器，可快速、准确地检测疟疾患者阳性血液样本中的疟原虫乳酸脱氢酶。基于聚二烯丙基二甲基氯化铵和p L1的传感器检测限分别为80个间日疟原虫/μL、92个恶性疟原虫/μL，基于聚烯丙胺盐酸盐和p L1的传感器检测限分别为74个间日疟原虫/μL、97个恶性疟原虫/μL[20]。Cheung等[21]描述了以高亲和力和特异性结合Pf LDH的DNA适配体2008s的选择和表征。2008s经20轮SELEX筛选获得，通过独特的扭曲发夹结构实现与靶标的特异结合，Kd为42 n mol/L。随后，基于2008s开发了一种敏感的核酸适配体拴系酶捕获(aptamer-tethered enzy me capt ure，APTEC)分析方法，该方法对恶性疟血样具有特异性，可以区分间日疟血样[22]。此外，报道显示PLDH表面的抗原决定簇可作为识别疟原虫属的生物标志物[23]。基于此，Frith等[24]以Pf LDH的表位寡肽为靶标，使用SELEX策略筛选获得的DNA适配体LDHp 11，也可用于区分恶性疟原虫和间日疟原虫感染。

Singh等[25-26]基于以高亲和力特异性结合恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(P.f alciparum gl uta mate dehydrogenase，Pf GDH)的硫醇化DNA适配体NG3(Kd＝79 n mol/L)，开发了可检测血清样品Pf GDH的电容式和场效应晶体管传感器，检出限分别为0.77、48.6 p mol/L。

最近，Joseph等[27]利用基因表达数据库、核糖体谱分析和结构建模，发现高迁移率族Box 1蛋白(high mobility group box 1 protein，H MGB1)高表达于恶性疟原虫的所有血液阶段。他们以恶性疟原虫的H MGB1为靶标，进行了14轮SELEX，从9个潜在的DNA适配体中确定了Pf R6，能以高亲和力[Kd＝(65±15)n mol/L]与靶标发生特异性结合。

2.2 靶向锥虫的核酸适配体 布氏锥虫(T.br ucei)引起的人类非洲锥虫病(昏睡病)，是一种流行于撒哈拉以南非洲的人兽共患寄生虫病[28]。布氏锥虫系一种细胞外寄生虫，可在宿主的外周血、毛细血管和组织液中繁殖。血液阶段的布氏锥虫表面约有1亿个变异表面糖蛋白(variant surface glycoproteins，VSGs)在细胞膜上作快速横向运动，细胞膜上同时也存在不变表面糖蛋白(invariant surface glycoproteins，ISGs)、受体复合物、转运蛋白分子等其他表面分子。这些表面分子一部分嵌入VSGs层内，分布在锥虫细胞体表面(包括鞭毛)，另一部分分布于鞭毛袋中，通过鞭毛基部周围质膜的内陷发挥胞吞和和胞吐作用。锥虫可通过DNA同源重组的方式改变VSGs的抗原特性，逃脱宿主免疫系统的攻击。锥虫基因组约编码1 000个不同的vsg基因，但特定时间段内仅表达1个VSG，1种VSG变体转换为另1种VSG变体的频率约10-2～10-7/每代细胞，属于随机事件，VSGs的抗原可变特性使宿主无法有效清除感染，同时加大了抗锥虫疫苗的研发难度[29]。

Ho mann等[30]以布氏锥虫细胞系 MITat 1.2(表面稳定表达VSG221)和MITat 1.4(表面稳定表达VSG117)为靶标，进行了12轮SELEX筛选。MITat 1.2、MITat 1.4可作为血液阶段布氏锥虫的代表，在60 min的孵育期内完成与RNA的结合。构建的RNA适配体库无法区分MITat 1.2和MITat 1.4(提示RNA适配体可能与VSG的恒定结构域或其他保守表面分子相互作用，不依赖于锥虫表面表达的特定VSG)，也无法识别昆虫阶段的布氏锥虫(结合效率≤0.1%)。核酸适配体库中结合能力最强的RNA适配体为2-16，与靶标的亲和力为(60±17)n mol/L，结合位点是鞭毛袋中42 k Da蛋白，具有将宿主免疫系统重定向至锥虫表面的潜力。适配体2-16与鞭毛袋中42 k Da蛋白结合后，会降解为含50个核苷酸的核心序列，通过特异性受体介导的内吞途径转运至细胞内的溶酶体[31]。为使2-16转化为热稳定、血清稳定的RNA适配体，Adler等[32]通过化学修饰制备了2′-脱氧-2′-氟、2′-脱氧2′-氨基-尿苷、2′-脱氧2′-氨基-胞苷取代的 RNA。结果显示，2-16被2′-脱氧2′-氨基-尿苷、2′-脱氧2′-氨基-胞苷取代后，活性丧失，仅2′-脱氧-2′-氟取代的2-16保留了与活锥虫鞭毛袋结合的能力(氟修饰前后的Kd分别为10、45 nmol/L)，具有热稳定性(Tm＝75℃)，与10 k Da的聚乙二醇结合后，在血清中的半衰期可达3.4 d，且保留了较高的生物学活性。Ho mann等[33]还报道了1种具有稳定G四联体结构的RNA适配体——N2，经13轮SELEX选择获得，与MITat 1.2的亲和力为(70±15)n mol/L。用嘧啶碱基的2′-氨基取代2′-羟基后，N2在人血清中的半衰期可超过30 h。该N2的结合仅限于布氏锥虫细胞体和鞭毛之间的鞭毛附着区，可能具有干扰鞭毛附着的潜力。此外，Lor ger等[34]以MITat 1.2和MITat 1.4的VSG保守结构域为靶标，经9轮SELEX筛选获得的RNA适配体——cl.57，与靶标的亲和力分别为(0.3±0.05)、(0.4±0.02)n mol/L，结合位点可能为VSG保守结构域的N末端。实验显示，未修饰的原始cl.57在血清中的半衰期为10 s，经2′-氟修饰后，其半衰期可达15 h。Zelada-Guillén等[35]基于cl.57开发了电位碳纳米管核酸适配体传感器，可对血液中低至10 p mol/L浓度的VSG作出实时响应，分析时间为2～10min。

克氏锥虫(T.cr uzi)引起的美洲锥虫病(恰加斯病)是西半球最重要的寄生虫病，心脏受累是最常见的特征，30%～40%的感染者会出现心肌病[36]。已知宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素、纤连蛋白、层粘连蛋白和血小板反应蛋白在介导克氏锥虫黏附和入侵宿主过程中发挥重要作用，在此基础上，Ulrich等[37]以硫酸乙酰肝素、纤连蛋白、层粘连蛋白和血小板反应蛋白为靶标，通过8轮SELEX筛选，获得了4个RNA适配体——HS6、F4、L28和T6，对靶标的亲和力依次为40、124、209和400 n mol/L。实验显示，1μmol/L RNA适配体即可抑制克氏锥虫对LLC-MK2猴肾细胞的体外入侵，抑制率约50%～70%。

Nagar katti等[38]利用全细胞SELEX策略开发了与克氏锥虫鞭毛体结合的血清稳定RNA适配体——Apt16、Apt 25、Apt 68和Apt 79，Kd分别为(22.96±1.6)、(22.12±3.9)、(7.62±1.63)和(29.92±5.62)n mol/L，可特异性捕获血流阶段的克氏锥虫。实验显示，包被Apt 68的磁珠可用于检测低至5个克氏锥虫/15 mL浓度的全血样品。此外，克氏锥虫作为一种细胞内寄生虫，其分泌的分泌抗原(T.cr uzi excreted secreted antigens，TESA)也可作为检测其感染的特异性标志物，Nagar katti等[39]经过10轮SELEX处理，筛选到可特异性识别TESA的RNA适配体Apt-L44，成功检测了急性期(7～28 d)和慢性期(55～230 d)感染小鼠血浆中的TESA。

2.3 靶向利什曼原虫的核酸适配体 利什曼原虫引起的利什曼病是一种广泛分布于亚洲、非洲、欧洲和中南美洲的寄生虫病，每年全世界约有70万～100万的报告病例[40-41]。利什曼原虫组蛋白与高等真核生物核心组蛋白的序列相似性主要位于球状区域，二者N末端和C末端结构域中的高度差异序列具备开发为疾病诊断、治疗靶标的潜力。已有研究显示，H2 A蛋白可作为犬内脏利什曼病血清学诊断工具[42-43]。Ramos等[44]以婴儿利什曼原虫组蛋白H2 A(L.infantu m histone H2 A，Li H2 A)为靶标，经3轮SELEX筛选，成功分离了一个名为SEL H2 A的DNA序列库，Kd为(2.065±0.652)n mol/L。SEL H2 A能与Li H2A特异性结合，通过酶联寡核苷酸检测和鉴定H2 A抗原的最低检测限为50 ng。蛋白质印迹结果显示，SEL H2 A可从低背景的寄生虫蛋白总裂解物中鉴别天然H2 A。该实验室后续从SEL H2A的DNA序列库中进一步分离出与Li H2 A亲和力最高的2个DNA适配体——Apt Li H2 A#1和Apt Li H2 A#2，Kd分别为(0.96±0.17)、(1.16±0.28)n mol/L。2个DNA适配体可从10 000个婴儿利什曼原虫前鞭毛体裂解物中检出Li H2A[45]。此外，该课题组以婴儿利什曼原虫组蛋白H3(Li H3)为靶标，筛选获得了可与靶标特异性结合的DNA适配体库SELH3，Kd为(0.94±0.19)n mol/L[46]。

动基体膜蛋白11(kinetoplastid membrane protein-11，K MP-11)是动基体寄生虫细胞膜的主要成分，为细胞骨架相关蛋白，可能与细胞迁移或鞭毛结构有关[47]。婴儿利什曼原虫的 K MP-11(Li KMP-11)为阶段特异性表达，不同生命周期阶段的Li K MP-11丰度和位置不同，鞭毛体阶段的Li KMP-11表达水平显著下调[48]。研究显示，利什曼原虫的K MP-11可作为自然感染过程中有效的抗体刺激剂和免疫动物T淋巴细胞增殖刺激剂[49-50]。Moreno等[51]在SELEX程序中使用胶体金来选择针对Li KMP-11的高亲和力DNA适配体，胶体金与Li K MP-11结合后可赋予其更高的质量，有利于进一步离心纯化。10轮SELEX选择后获得了DNA适配体库SELK10，蛋白质印迹结果显示，SELK10能从婴儿利什曼原虫裂解物中鉴定出天然Li K MP-11，可作为抗Li K MP-11的多克隆化学抗体。基于此，以SELK10为识别元件，开发了一种用于检测Li K MP-11的电化学核酸适配体传感器，可 检 测 到 25 μg/μL(2.27 μmol/L)的Li K MP-11[52]。

真核生物的poly A结合蛋白(poly A binding protein，PABP)与mRNA的3′末端的poly A结合，参与翻译起始、终止和mRNA从细胞核到细胞质的转运[53-54]。Guerra-Pérez等[55]以婴儿利什曼原虫poly A结合蛋白(Li PABP)为靶标，通过4轮SELEX，构建了DNA适配体库SELLi PABP，Kd为(3.87±0.67)n mol/L。随后，从SELLi PABP群体中分离了3个高亲和力DNA适配体——Ap PABP#3、Ap PABP#7和Ap PABP#11，可从2 500个婴儿利什曼原虫前鞭毛体裂解物中检测到Li PABP。Ap PABP#3、Ap PABP#7和Ap PABP#11的Kd分别为(5.4±1.1)、(6.0±2.6)和(10.8±2.7)n mol/L，均可在低纳摩尔浓度范围内特异性识别Li PABP，50 n mol/L DNA适配体可检测6.25 ng Li PABP。研究显示，3个DNA适配体均可实现对利什曼原虫细胞裂解物中Li PABP的纯化，与Ap-PABP#11相比(低于50%)，Ap PABP#3、Ap PA-BP#7纯化效率达75%以上。然而，仅Ap PABP#11能破坏Li PABP与poly A的结合，可作为影响利什曼原虫翻译的潜在抑制剂，适用于前鞭毛体和鞭毛体2个阶段的Li PABP。

Bhattacharyya等[56]以热带利什曼原虫(L.tropica)线粒体为靶标筛选获得的核酸适配体序列含有t RNA的反密码子臂、D臂，VT区和受体茎等序列基序，可影响线粒体介导的t RNA运输，以此干扰热带利什曼原虫的生长发育。

2.4 靶向其它寄生虫的核酸适配体 Long等[57]利用虫卵SELEX技术筛选获得了特异性结合日本血吸虫(Schistosoma j aponicu m)虫卵的2个DNA适配体——LC6和LC15，结合率分别为83.6%和70.2%，但仅LC15可以识别和捕获肝组织中的日本血吸虫卵，检出率为80.5%。

切割因子的25 k D亚基(cleavage f actor I m 25，CFIm25)是一种能与poly A聚合酶相互作用的RNA结合蛋白，对寄生虫毒力和存活至关重要，CFIm25的沉默可降低寄生虫的活动性并诱导细胞死亡。Ospina-Villa等[58]通过7轮SELEX开发了针对溶组织阿米巴(Entamoeba histol ytica)的CFI m25的RNA适配体——C4和C5，可通过改变募集、切割和聚腺苷酸化反应，影响溶组织阿米巴滋养体的增殖、存活和毒力特性。

3 展 望

核酸适配体是利用核苷酸之间严格的识别能力和亲和力而设计的人工合成寡核苷酸，靶标范围广泛，已被应用于识别各种靶标分子。核酸适配体既具有检测的潜在价值，也可作为抗寄生虫药物的递送载体，在寄生虫学领域展现了良好的应用前景。经典的SELEX方法已被证明是一种功能强大且有效的核酸适配体选择程序，但仍需进一步优化以提高筛选效率。引入阴性SELEX有助于消除与环境成分结合的非特异性序列，尤其是与固相基质结合的非特异性序列。基于固相基质磁珠的SELEX策略，可在磁场作用下快速分离与靶标结合的核酸适配体。利用高通量测序技术使每轮SELEX筛选可见，通过定量评估整个筛选周期中文库组成的动态变化，可更高效、省时地获得高亲和力核酸适配体[59]。将SELEX方法与毛细管电泳、微流控等技术联合，可缩短筛选轮次和时间，降低筛选成本，提高核酸适配体的检测灵敏度和对不同靶标类型的适用性[60]。需要注意的是，以纯化蛋白为靶标的SELEX策略不适用于不溶性蛋白、未知蛋白和仅以天然构象发挥作用的蛋白。对于这些局限，基于全细胞的SELEX策略可作为一种合理的替代方案。以整个细胞为靶标进行筛选，可保持靶标的天然构象，不需要预先进行靶标序列分析和蛋白纯化。但细胞SELEX技术是一个复杂的过程，筛选过程中不可避免地会遇到细胞死亡，死细胞会与核酸适配体发生非特异性结合引起假阳性，营养不良和培养时间过长等不良培养条件可能使细胞表面生物学结构发生变化，从而为下一轮选择保留了无用的核酸序列[61]。综上，改进核酸适配体的筛选方法，将有望为进一步鉴定出特异靶向寄生虫的分子和发展有效诊断试剂与药物提供坚实的基础。