谷氨酸产生菌诱变技术的研究进展

覃菲菲

（广西-东盟食品检验检测中心，广西南宁 530021）

诱变育种广泛用于谷氨酸生产菌育种，是首选的育种方法，本文主要论述谷氨酸产生菌诱变技术的最新研究进展，根据对谷氨酸产生菌诱变的因子不同，可分为以下四大类：物理诱变技术；化学诱变技术；复合诱变技术；常压室温等离子体诱变技术。从各个方面综合论述了诱变技术的原理、应用以及特点。探索新方法和新技术，为日后提高工业发酵谷氨酸的产量和开发优质谷氨酸产生菌株提供数据支持和理论基础。

1 物理诱变

物理诱变技术是利用各种射线的辐射作用，如紫外线，X射线，γ 射线等，造成菌体的DNA 的结构变化，从中筛选正向突变的突变体，最终获得目的菌株。常用的物理诱变技术有紫外线诱变与X 射线诱变两类。

紫外诱变是物理诱变技术的代表，也是一种有效的诱变手段。通过紫外诱变对出发菌体进行处理后，能获得预期的结果，如副产物高产或改变菌体性状。

设定一定剂量的紫外线对菌体辐射一段时间，紫外线即能引起DNA 变化，使菌株突变。紫外线引起的DNA 构象变化很多，包括DNA 片段化，双链DNA 分子交叉连接，胸腺嘧啶二聚体的形成等。杜军等以GDK6菌作为出发菌株，通过紫外线定向诱变L-谷氨酸生产菌，结果GDK9菌株产酸能力提高且高产性状遗传稳定，糖酸转化率达到 62.2%。吴学超等把B6-1株经过三轮紫外诱变，最终得到聚谷氨酸高产的突变株W003，聚谷氨酸的发酵产率从起始菌10.9g/L 提高到20.5g/L。

X 射线是波长介于紫外线和γ 射线 间的电磁辐射。同步辐射源可产生高强度的连续谱X 射线，使用其产生的X 射线直接对菌体辐照一段时间，使染色体断裂，最终造成遗传物质变异。

同步辐射软X 射线已被应用于微生物诱变。软X 射线能量转移密度比硬X 射线大，所以相对生物效应高。低能量的软X 射线对菌体的DNA 中某些重要的微量元素具有特殊的吸收作用，从而导致在菌体细胞中产生更多的染色体畸变。刘苗等以SW07-1为原始菌株，经过软X 射线诱变，使菌株在生长过程中逐步适应较高的温度，最终获得耐高温的谷氨酸突变菌株，达到育种目的。

2 化学诱变

化学诱变是通过分子结构不稳定的试剂开展的，引起遗传物质损伤或错误修复产生突变体，可导致基因突变，或选择性作用于一个特定的基因、核酸。依据诱变剂与DNA 作用方式的不同可分为烷化剂诱变、移码突变剂诱变两大类。

烷化剂是化学诱变技术中最常用的试剂，包括硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、甲基磺酸甲酯等。为了提高菌株的正突变率，通常采用两种或两种以上烷化剂同时或交替使用，价格低廉、操作简单、不需要复杂昂贵的仪器设备、效果明显。

烷化剂在菌体内能形成C2+或活泼亲电性基团，实验设定一定浓度的烷化剂加入菌体培养基中，菌体生长过程中，试剂可以与生物大分子中含有丰富电子的基团发生共价结合，使其丧失活性，或使DNA 分子发生断裂。王卫对菌株HG-009进行了化学诱变来提高γ-聚谷氨酸的产量，通过2%的硫酸二乙酯（DES）诱变15min，将γ-聚谷氨酸的产量由61.90mg/g 提升到71.39mg/g。朱丽娟以谷氨酸产生菌HD11为出发菌株，使用硫酸二乙酯对菌株进行单因子诱变，筛选出聚谷氨酸高产菌株F12，聚谷氨酸产率达到20.27g/L，比出发菌株高39.2%。

移码突变剂具有平面三环结构，以某种浓度加入菌株培养基后，随着菌体的生长，试剂可插人到正常DNA 双链分子临近的碱基对之间，导致碱基突变，使遗传密码转录和翻译发生错误，引起菌种性状改变。Ferguson 等认为移码突变更多可能发生在重复碱基区域内。移码突变剂主要包括吖啶黄、吖啶橙等吖啶类化合物以及原黄素、溴化乙锭等。于芳以谷氨酸产生菌ATCC13870为出发菌株，对其进行吖啶黄与紫外线复合诱变，定向选育然后筛选得到菌株Ⅱ-169，其酸产量达23.8g/L，较出发菌提高14.4%，副产物量降低了12.5%。

3 复合诱变

随着研究的进展，诱变的手段更加多样化，研究人员已不局限于单一因素对菌株的诱变。为了提高诱变的效果，通常使用两个或两个以上的诱变剂同时或依次作用，甚至是物理因子和化学因子配合来复合诱变的处理方法。

主要包括三个方面：多种物理因子诱变、物理—化学因子复合诱变、化学—物理—化学因子交叉复合诱变。李雪等利用CGMCC3336为出发菌株，通高盐-高温复合手段得到高转化率菌株TKBCPG-009，新菌株能将发酵底物谷氨酸钠的转化率提高16%。乔长晟等以BCPG006 为起始菌株，通过紫外线和He-Ne 激光复合诱变处理，选育出的突变株BCPG078，发酵后所得聚谷氨酸的量为16g/L，为起始菌的2.67倍。张瑞等以γ-多聚谷氨酸解淀粉芽胞杆菌C1为出发菌株，对其进行紫外线-亚硝基胍复合诱变，通过复合诱变选育得到正突变菌株C1-6，其γ-PGA 的产量由18.4g/L 提高到24.2g/L，增加了31.5%。

物理诱变与化学诱变技术发展时间较长，各方面研究较成熟，所以谷氨酸菌诱变技术大部分首选二者进行复合诱变。根据当下的研究结果，综合各种因子的复合诱变比单一因子诱变效果好。

4 常压室温等离子体诱变

随着科技的发展，各学科间的交叉应用受到国内外科学家的重视，研究出更先进、更复杂的技术，来适应更高的研究标准。目前研究中出现的新型诱变方法主要有：常压室温等离子体、高能电子流、超高压、离子注入等。

其中常压室温等离子体（ARTP）在生物诱变育种领域得到广泛应用[7]。ARTP 诱变技术有能够有效造成DNA 多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株，操作简便成本低，无毒无害等优点

常压室温等离子体（ARTP）能够在大气压下产生温度在25～40 ℃的具有高活性粒子浓度的等离子体射流。等离子体中的活性粒子作用于菌种，能够使细胞膜的结构及通透性改变，并诱发细胞启动SOS 修复机制，修复过程中会产生种类丰富的错配位点，进而使DNA 序列及其代谢网络显著变化，最终导致菌种突变。

陈双喜等对γ-聚谷氨酸产生菌HD11进行等离子体诱变处理，获得高产菌株HNCL1266，其γ-聚谷氨酸摇瓶发酵产量为26g/L，较出发菌提高了30%。梁玲等以谷氨酸棒杆菌GY1为研究对象，采用ARTP 进行全局诱变，经过初筛与摇瓶复筛，获得突变株YAG117，其发酵L-谷氨酸含量达16.3g/L，较出发菌株提高13.9%。孔帅等以谷氨酸棒杆菌23798为原始菌株，对其进行ARTP 诱变，发酵培养复筛48h，选育出一株高产L-异亮氨酸诱变谷氨酸棒杆菌B1，L-异亮氨酸产量达18.5g/L，比原始菌株提高62.03%。杜丹清等以γ-聚谷氨酸地衣芽孢杆菌QY-27为出发菌株，通过常压室温等离子体（ARTP）诱变，筛选获得一株高产菌株QS-21，γ-聚谷氨酸的产量较出发菌株的9.12g/L 提高了42.26%。

ARTP 诱变技术是综合了物理和化学诱变特性为一体的新方法，在扩大菌种源，优良品种的筛选，及提高诱变效率等方面，将发挥重要的作用。随着各学科间的合作日益普遍，高新技术已进入学科交叉研究时代，ARTP 诱变技术就是其中典型的例子，不久之后会得到更广泛的应用。

5 结语

目前谷氨酸菌株育种还是采用诱变技术。因其具有简便、易行、安全以及菌种遗传稳定性高等特点，每一种诱变技术的基本原理、作用机制均不相同，其中涉及到物理、化学、生物等多种学科，研究空间大，有利于应用实验。诱变技术的发展已经相对成熟，但仍有突破点：复合诱变的可能性很大，可尝试不同的组合进行实验；当诱变效率低时，应考虑到诱变因子的参数设定；新技术如常压室温等离子体诱变等具体是何种效应引起的基因突变还未有明确定论，应加大基础理论的研究；诱变技术存在局限性时，可考虑与其他技术结合使用；把原生质体融合以及生物工程技术应用到诱变中。随着学科间的交叉领域研究的深入，诱变技术技术在未来会有很大进展，可以选育出更高产和更高性能的谷氨酸产生菌株。