基层医院新型冠状病毒核酸检测与生物安全防护探讨

钟宏文 朱丽康 温晓静 朱凯琦 刘让万

（赣县区人民医院 江西赣州 341100）

1 前言

新型冠状病毒（COVID-19）是一种RNA 病毒，以喷嚏、咳嗽等呼吸道飞沫传播及接触传染为主，会引起人类呼吸系统感染，发热、乏力、干咳，逐渐出现呼吸困难是感染者的一般临床症状， 绝大多数感染者预后良好，少数患者起病症状轻微，发热不明显，严重者出现急性呼吸窘迫综合征、感染性休克、难以纠正的代谢性酸中毒及重度凝血功能障碍等症状，甚至导致死亡，且该病毒传染性极强[1]。 快速、及时、准确的诊断和鉴别诊断技术对COVID-19 诊治和疫情的防控尤为重要。目前，方法的多样性和多种方法的互补使用为COVID-19 的检测两大趋势。 细胞培养、电镜检测、血清学检测、核酸检测等为主要检测方法[2]，由于实时荧光RT-PCR 核酸检测技术操作简单，低成本，结果准确，特异性强、灵敏度高、重复性好，而且检测过程封闭，较好地解决了环境污染问题，已成为临床COVID-19 检测的主流方法[3]。 实时荧光逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）核酸检测技术已被列入国家卫健委COVID-19 诊疗规范，是COVID-19 感染的最重要病原学确诊指标及痊愈判断标准，也是目前临床首选的技术。

2019 年 12 月，湖北武汉暴发 COVID-19 疫情，随后蔓延至全国，截至2020 年2 月29 日，现有确诊病例35 239 例，累计治愈出院病例41 625 例，累计死亡病例2 870 例，累计确诊病例79 824 例，其中，赣县区现有确诊病例7 例治愈出院，累计死亡1 例，累计确诊病例9 例，已连续24 天无新增确诊病例。 当前疫情防控形势正积极向好的势态发展，但疫情依然严峻复杂，已严重影响社会经济的发展和人们的生产生活，威胁人民群众的生命健康。为了有效遏制疫情传播蔓延，阻断病原体在医疗机构内传播，保证医疗质量与安全，基层医院生物安全二级（BSL-2）实验室开展COVID-19 检测大势所趋。

本文参考国家卫健委最新颁发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》（国卫办医函〔2020〕184 号）、《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》（国卫办科教函〔2020〕70 号）和中国疾病预防控制中心的制定的《新型冠状病毒肺炎防控方案（第五版）》及附件《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第五版）》（国卫办疾控函〔2020〕156 号），中华医学会检验分会发布的《2019 新型冠状病毒肺炎临床实验室生物安全防护专家共识》等文件，介绍了赣县区人民医院检验科在BSL-2 实验室开展COVID-19多重实时荧光RT-PCR 核酸检测策略及试验人员的生物安全防护应对措施。

2 开展COVID-19 实时荧光RT-PCR 核酸检测的条件

《新型冠状病毒肺炎防控方案（第五版）》及附件《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第五版）》将COVID-19 作为急性上呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》甲类管理的乙类传染病。COVID-19 暂归属于第二类生物危害等级的高致病性病原微生物[4]。 严格按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《能够感染人类的高致病性微生物（毒物）的种类或样本运输管理条例》（卫生部45 号令）等相关要求采集、运送、检测、储存标本。依据《新型冠状病毒实验室生物安全指引（第二版）》相关规定：在生物安全二级实验室（BSL-2）开展COVID-19核酸提取，使用生物安全三级实验室的个人保护[5]。生物安全二级及以上的医疗机构临床实验室开展COVID-19 核酸检测须经设区的卫生主管部门备案，同时具备以下条件：（1）实验室必须经省级卫生主管部门审核备案。（2）实验室检测人员必须经省临床检验中心基因检测技术培训合格 （持有岗位合格证书）。 （3）实验室仪器设备必须满足高效过滤效率（HEPA）检测合格的A2 及以上专用生物安全柜，生物安全达到二级（P2）级别以上。 （4）试剂应选择使用经国家药监局批准能检测COVID-19 基因组中开放读码框1ab（ORF1ab）和核壳蛋白（N）或小包膜蛋白（E），有注册证号厂家生产的检测试剂，并在使用前做性能验证。 赣县区人民医院实验室选择济南鑫贝西 BIOBASE-BSC-1100ⅡB2-X 生物安全柜 （国械注准20163542275），杭州安誉AGS-4800（国械注准20173400921）实时荧光定量PCR 扩增仪，主要使用中山达安公司（国械注准20203400063）、湖南圣湘公司（国械注准20203400064）生产的试剂备用。

3 BSL-2 实验室内的三级个人防护

在BSL-2 实验室内的所有操作必须符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》的三级个人防护要求，做好个人防护用品的穿戴：穿一次性防护服、工作服外穿隔离衣、防渗漏胶鞋、短双层一次性鞋套，戴医用防护口罩或N95 口罩、工作帽、护目镜（或面屏）及双层防渗漏乳胶手套，加强手卫生。进入BSL-2 实验室严格按照BSL-2 生物安全防护用品的穿戴和脱卸流程操作，脱卸一次性防护用品时须注意每脱卸一件防护用品前都先用75%酒精喷洒防护用品的外表面进行消毒。 护目镜（或面屏）用有效氯浓度1 000 mg/L 消毒液浸泡30 min，清水清洗晾干后再进行重复使用。

4 临床检测流程

在赣县区COVID-19 疫情防控指挥部统一指挥下，经赣县区人民医院COVID-19 防控领导小组协调，通知检验科主任开始准备承担COVID-19 感染者、疑似病例、门诊发热留观人员、密切接触者及集中隔离点医学观察人员的核酸检测的临床检验工作。

4.1 准备工作

科主任接到通知后，立即召开科室紧急启动会议，传达通知精神，分配布置工作任务。 结合科室实际应急安排3 名持有PCR 上岗证的检测人员（其中有高级职称1 名，中级职称2 名），邀请试剂厂家技术人员进行培训，上级医院基因扩增实验室（PCR实验室）专家指导及医院院感专家督导，同时做好试剂、耗材储备、防护用品的调备等工作。 明确要求对疑似或确诊患者的样本要有显著的特殊生物安全标识，由临床医师或疾控人员负责样本采集，统一专人送检，专人接收，集中分批检测，以减少暴露的机会和个人防护装备的消耗。实验室检测人员按照《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》的三级个人防护要求做好个人防护， 随时准备接收患者样本进行检测。

4.2 样本运送及接收

样本运送人员戴医用N95 口罩和防护眼罩，穿工作服外隔离衣、二层鞋套及防渗漏长靴，戴双层乳胶手套和工作帽按生物安全二级个人防护流程做好防护[6]。 收集样本时必须仔细检查采样容器是否完好无损并盖紧， 采样容器上是否写明患者姓名、病区/床号、样本的种类及采样时间（医生或护士填写），确认样本合格并在样本接收登记本上做好登记后，放置于有生物危害标识的具有独立的双层密封包装袋、保存盒、密闭的“COVID-19 检测样本专用运送箱”，用辅助容器固定，以免颠簸导致泄漏或破碎，再对包装袋、保存盒、转运箱的外表面喷洒75%酒精或有效氯浓度1 000 mg/L 消毒液消毒。 外送样本需在“COVID-19 检测样本专用运送箱”内放置医用冰袋，温度保存4℃。 样本运送人员在离开病区时，以75%酒精喷洒手套、外层隔离服和鞋套。样本运送人员将“COVID-19 检测标本专用运送箱”置于避光、防雨、防震的样本运送车上，须非常仔细、小心地送至实验室。 核酸检测实验室工作人员要做好三级个人防护，在BSL-2 实验室内做好接收样本、核对信息、编号排序工作，75%酒精喷洒后取出内层样本管（内含病毒保存液）包装桶，并将其转移至生物安全柜中，打开内包装，取出样本管，75%酒精喷洒外表面，放置于56℃恒温水浴锅，灭活30 min。

4.3 标本检测

工作人员严格按照COVID-19 核酸（ORF1ab 基因/N 基因）RT-PCR 检测流程操作，在试剂准备区配制裂解工作液及反应体系；在样本处理区生物安全柜内完成灭活样本的处理、核酸裂解及提取、加样；到扩增区进行实时荧光PCR 检测，按标准操作程序设置样本信息、设定扩增参数和程序：50℃/15 min→95℃/15 min→94℃/15 s、55℃/45 s，45 个循环，扩增时间105 min，分析判断结果，审核报告，记录COVID-19核酸（ORF1ab 基因 ／N 基因）RT-PCR 检测流程表。因开盖、加样、离心过程可能会产生气溶胶，试验操作中应注意：样本开盖前，观察有无样本溢出，轻轻旋转打开样品盖；当用干浴，将子弹头盖紧，防止爆盖；每次离心时，须等离心机完全停止后，静止10 min；每次加样动作要轻柔避免飞溅，忌用加样枪反复吹打液面，在操作过程中，动作要轻柔，工作人员双手不能随意进出生物安全柜。

4.4 清除和消毒

试验结束后，及时清理生物安全柜内的物品，以75%酒精擦拭外表面后移出，重新归位。用75%的酒精擦拭生物安全柜墙壁和台面，并通风30 min 后封闭运行。同时检查操作的区域压力是否在正常范围。用75%酒精喷洒PCR 扩增仪外表面，10 min 后再次擦拭。 用含1 000 mg/L 浓度有效氯消毒液擦拭操作台面、地面、物体表面，紫外线照射60 min，每天至少2 次。 实验室工作人员严格按照BSL-2 实验室进出操作规程离开实验室。

4.5 废弃物处理

剩余或废弃样本等污染物装入高压灭菌袋中，用高压指示带扎口，并用75%酒精喷洒袋外侧后，移出生物安全柜放置PCR 核酸检测标本废物专用运送箱内。工作人员做好二级生物安全个人防护，经121℃，15 min 高压蒸汽灭菌后放入医疗废物垃圾桶统一处理，并做好样本销毁记录。

5 安全危险及其防护措施

由于COVID-19 具有多种传播途径，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》和《新型冠状病毒肺炎防控方案（第五版）》中已明确指出“在相对封闭的环境中长时间暴露高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能”，实验室高频率检测感染病人咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本的核酸，因此生物安全防护尤其是气溶胶感染途径的防控尤为重要。 由于样品的处理过程中，生物危害性可能出现：移动样本管可产生振荡，开盖时气溶胶喷出；当样本过量或倾斜，可能发生外溢；离心后或干浴管爆盖都有可能产生气溶胶。 因此，所有COVID-19 核酸检测样本处理前必须用56℃，30 min 灭活或75%乙醇预处理[7]，严格按照要求进行防护，遵循《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》的要求，应在生物安全柜内接收、处理标本，采用医用防护口罩或N95 口罩，工作服外穿隔离衣，戴双层乳胶手套、医用防护帽、护目镜（或面屏），加手卫生进入BSL-2 实验室。

5.1 防止气溶胶产生和吸入的个人防护措施

在生物安全柜台面铺上纸巾；待离心机完全停止后，静止10 min，样本盖在生物安全柜中轻轻旋转打开；试验人员试验时佩戴医用防护口罩或N95 口罩、双层乳胶手套和护目镜（或面屏）。

5.2 防止标本溢出的个人防护措施

当生物安全柜内样本洒溢时，用含5 500 g/L 有效氯消毒30 min 以上；当可能出现较严重的实验室污染时，应保持实验室空间密闭，禁止无关人员出入，以避免污染物发生扩散，用含有5 500 g/L 的有效氯消毒液的吸水纸巾对污染区进行覆盖消毒30 min以上[8]，严格按照处理活病毒生物安全操作的要求清理污染物，并用高压蒸汽灭菌处理，实验室开窗通风，防止次生危害。 处理后操作人员立即更换外层手套。

5.3 离心、干浴样本管爆盖时的个人防护措施

若离心机正在运转，先关闭电源，保持离心机密闭30 min，让气溶胶沉积；若离心机已停止，保持盖子密闭30 min；实验室工作人员应戴双层橡胶手套，用镊子取出爆盖样本管，放入盛有含5 500 g/L 有效氯消毒剂容器中浸泡30 min；用75%酒精擦拭2 次离心机、干浴器内腔及外盖，用水清洗后干燥，移动紫外线灯照射60 min。 所有清理材料按感染性废物处理[9]。

6 结语

综上所述，在基层医院的BSL-2 实验室内开展COVID-19 核酸检测可以在第一时间为临床医生提供诊断依据，有助于疾病治疗和预后判断；为疫情防控提供技术支持，有助于遏制疫情扩散蔓延势头。由于临床实验室人员检测临床样本含高致病性活病毒微生物，需要在56℃条件下灭活30 min 或使用75%乙醇预处理所有COVID-19 核酸检测样本，并在生物安全柜内进行样本处理。 实验室工作人员应加强COVID-19 实验室检测技术指南及生物安全指南学习，增强生物安全意识，科学、理性、规范做好个人防护，熟练掌握检测技术，严格遵守操作规程，确保实验室工作人员零感染。