NA单药及序贯联合Peg干扰素对慢乙肝患者CD11c+mDC功能的影响

（大连市第六人民医院，辽宁 大连 116000）

HBV感染是一个严重的全球性公共卫生问题，全世界慢性乙型肝炎（慢乙肝）感染者的人数超过3.5亿人。中国是世界上感染乙型肝炎病毒人数最多的国家。目前中国约有9300万例乙型肝炎病毒携带者，其中慢乙肝患者2000万～3000万，每年近30万人死于与乙型肝炎相关的肝硬化和肝癌等。慢乙肝仍然是肆虐我国的重要疾病。HBV感染的慢性进展决定了抗病毒治疗是一个慢性过程，至今公认的抗HBV治疗药物有干扰素（IFN-α）和核苷（酸）类 似物（NA）两大类。现有的这两大类抗HBV药物各有优缺点：NA抗病毒起效快，但1年HBeAg血清学转换发生率低，即便延长疗程，转换率也很难提高，且疗程不固定，虽具有调节免疫的功能，但免疫功能调节不持久，大多数人不能实现停药；而IFN-α直接抗病毒作用较弱，抗病毒起效较慢，但其具有疗程相对固定，不易病毒耐药，HBeAg和HBsAg血清学转换率高且应答持久，具有调节免疫和抗病毒双重功效的优势。因此，优化现有抗HBV治疗方法具有重要意义。因二者抗HBV作用靶位及机制不同，联合应用理论上可实现其优势互补。

1 资料与方法

1.1 研究对象：收集我院接受NA单药治疗和序贯Peg干扰素患者基线、治疗24周及治疗48周时的外周血各10 mL（单药及序贯组各20例）；并选取健康对照10例。序贯Peg干扰素的时机：HBeAg阳性的慢乙肝患者核苷类药物应用3个月，HBeAg水平较基线下降大于50%；和（或）HBSAg低于1500 IU/mL；核苷类药物应用3个月～2年的慢乙肝患者，HBeAg低于500 S/CO，和（或）HBSAg低于10000 IU/mL。入组标准：入组CHB患者均为大连市第六人民医院住院及门诊患者。诊断符合2000年《病毒性肝炎防治方案》标准。年龄＜50岁，男女不限，6个月内未使用任何抗病毒药物及免疫调节剂。健康对照组无感染乙、丙型肝炎病毒及各种过敏史，肝功能正常。排除标准：排除人类免疫缺陷病毒、HCV及丁型、戊型肝炎病毒感染。退出和终止标准：抗病毒治疗依从性差，中途停止抗病毒治疗者。研究参与者参加研究的时间：48周。招募过程：临床诊疗过程中招募符合入组标准的核苷类药物及序贯联合Peg干扰素受试者。

1.2 主要试剂及仪器：异硫氰荧光素（FITC）标记鼠抗人谱系标记（包括CD3、CD14、CD16，CD19、CD20、CD56）单克隆抗体购自美国Caltag公司；藻红蛋白（PE）-CD11c+，别藻蓝蛋白（APC）HLA-DR购自美国eBioscience公司。细胞周期流式检测试剂盒。

1.3 方法：①外周血mDC频率检测：分离外周血单个核细胞（PBMC），磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，加入FITC标记的Lineage（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56），PE标记的CD11c，APC标记的HLA-DR mAb各10 μL，室温避光孵育30 min，1500 r/min离心5 min，10 g/L多聚甲醛固定，同时设同型对照，上流式细胞仪检测。Lineage CD11c+和HLA-DR+双阳性的细胞为mDC。②外周血流式细胞仪检测髓样树突细胞mDC表面共刺激分子CD80，CD86的表达。

1.4 统计学分析：应用SPSS13.0软件进行统计学处理。正态分布数据用（±s）表示，两组均数比较采用t检验，多组均数的显著性检验采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血mDC频率的变化：通过流式细胞仪技术检测特异性表面膜标志，谱系标记lineage（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56）阴性，CD11c、HLA-DR双阳性为mDC亚群.对于20例NA单药组慢乙肝患者及20例序贯联合Peg干扰素组患者外周血mDC占PBMC的百分比进行检测，差异有统计学意义P＜0.05），序贯联合组外周血mDC占PBMC的百分比明显高于单药治疗组（0.77±0.56）%VS （0.38±0.61）%，P＜0.05。

2.2 外周血流式细胞仪检测髓样树突细胞mDC表面共刺激分子CD80，CD86，HLA-DR的表达。NA单药组CD80和CD86表达率分别为（2.35±0.72）%、（18.71±10.93）%，序贯联合Peg干扰素组CD80和CD86表达率为（6.87±8.15）%、（45.26±21.54）%，序贯联合Peg干扰素组表达率高于单药治疗组（P＜0.05），两组CD80表达率比较差异有统计学意义。

3 讨 论

DC在慢性感染患者对HBV的低应答或无应答的免疫反应中起着重要作用[1]，现认为其机制是DC的免疫调节和抗原提呈功能有特异性的缺陷导致HBV慢性持续性感染。DC按照细胞表面分子特点分为髓样树突状细胞（myeloid Dendritic Cell，mDC）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid Dendritic Cell，pDC）两个亚群，其中mDC主要发挥抗原递呈功能，促进Th1细胞分化和细胞免疫的发生。乙型肝炎患者体内细胞毒性T淋巴细胞对HBV应答的强度是决定病毒能否被清除的主要因素，体内高水平的病毒载量导致了持续低下的T淋巴细胞反应。

有研究表明：针对我国慢乙肝患者以基因C型为主，两种药物单用整体停药率均低，疗效不高；所以二者联合是否能取得更好的抗病毒效果是人们一直在探索研究的方向。我国学者任红等进行的一项全国多中心随机开放研究（NewSwitch）显示核苷（酸）类似物治疗1～3年达到HBV-DNA＜200 IU/mL及HBeAg清除的患者序贯Peg-IFN治疗48周可实现较高的HBsAg阴转率和血清转换率（16.2%，12.5%），使用Peg-IFN前HBsAg低水平者有更高的表面抗原清除率；OSST研究是宁琴教授在我国开展的一项全国多中心，随机对照临床研究，研究结果表明：应用恩替卡韦治疗获得病毒学抑制的患者联合/序贯至有限疗程的聚乙二醇干扰素（Peg-IFN）治疗，可显著提高患者HBeAg血清学转换率和HBsAg清除率；荷兰学者Brouwer等[2]对2项全球性RCT研究（HBV9901研究和ARES研究）进行析因分析，该研究得出在ETV基础上联合24周Peg-IFN-α治疗，后续ETV治疗的方案更优越。以上三项研究均证实联合治疗抗病毒作用更显著。上海交通大学附属瑞金医院的谢青教授和她的团队在2008年研究发现：CHB患者外周血mDC频数与血清HBV病毒载量及血清ALT水平存在负相关。该研究还发现CD11c+mDC作为发挥抗原提呈，促进Th1细胞极化和细胞免疫的重要始动因子，其功能的降低是CHB产生免疫耐受的原因之一。另外，HBV患者mDC分泌IL-12水平低下，可能是HBV持续感染机体免疫难以清除的另一原因[3-4]。

近年来的研究证实初始联合并没有显著提高HBeAg的血清转换率；而先用NA降低病毒载量，使细胞免疫功能得到短暂的恢复，同时序贯联合长效干扰素可以增强细胞免疫的功能，增强HBeAg血清学转换和HBsAg的清除。但目前慢乙肝防治指南中并未推荐序贯联合治疗方案，考虑可能与其免疫学机制不清有关。

本次研究得出结论：①NA联合Peg干扰素较单用NA可以的提高CHB患者外周血mDC频数；DC是功能强大的抗原递呈细胞，在诱导特异T细胞反应中起非常重要的作用[5-6]。近几年，国内外诸多文献报道慢乙肝患者外周血树突状细胞数量、表型及功能均存在异常[7-9]，本研究证实联合治疗可以提高CD11c+m功能，激活天然免疫，启动更持久的适应性免疫，进一步提高CHB患者HBeAg血清转换率，提高病毒DNA的清除率，缩短治疗疗程。②联合治疗可以提高CD11c+mDC表面共刺激因子CD80，CD86表达率；本研究的结果证实序贯联合治疗能够有效刺激CD11c+mDC的活化，明显上调细胞表面CD80、CD86的表达，表明序贯联合治疗可能通过调节CD11c+mDC的表型和功能，参与HBV的控制和清除，这将为下一步深人研究序贯联合在HBV感染中的免疫本质，具体信号转导通路与调控环节提供理论依据[10]。

因此，结合我们的研究，初步得出结论NA序贯联合Peg干扰素可以提高CD11c+mDC的功能，激活天然免疫，启动更持久的适应性免疫。本课题的意义在于从免疫学机制方面研究干扰素抗病毒的作用，进一步为患者提供更好的治疗方案，为我市病毒性肝炎的防治做出贡献，使我市年轻的慢乙肝患者实现停药；而且我国目前干扰素应用比例较低，整体不足10%，我市应用比例更低，本研究拟改变对干扰素认识不足，整体应用低下的局面，为患者提供更优化的治疗方案。