乳腺癌干细胞再生及其自我更新的通路

赵莉莉，李青颖,2，高攀,2，付红勇，赵承志，王艺，杨琛擘，豆萌萌，王超尘，吴息凤，欧阳宏伟，申培红

(1.郑州大学附属肿瘤医院 a.临床病理中心；b.肿瘤研究院；c.妇女肿瘤科，河南 郑州 450008；2.河南大学第一附属医院 乳甲外科&肿瘤内科，河南 开封 475000；3.郑州大学第一附属医院 博士流动站，河南 郑州 450008；4.浙江大学医学院，浙江 杭州 310012)

近年来，肿瘤的发病率越来越高，病死率逐年上升。乳腺癌被称为是威胁女性生命健康的最危险的杀手，其发病率居女性恶性肿瘤的第2位，每年约有140万人被确诊为乳腺癌，而约有50万人死于乳腺癌[1]。干细胞概念的提出，也让大多数的研究认为乳腺癌复发转移的特点与干细胞相关[2]。根据上述理论，乳腺癌是一种由具有功能异质性的细胞群组成，只有少数的具有干细胞特性的乳腺癌细胞才具有自我更新和分化的能力，这才是乳腺癌易发生、发展、复发和转移的原因。乳腺癌肿瘤干细胞概念的提出，为乳腺癌的治疗提供了新的靶向策略。本综述总结了乳腺癌干细胞再生和自我更新主要方式的近期进展，以期为相关研究提供理论支持。

1 上皮间质转化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)发生乳腺癌干细胞恶性转化的机制

20世纪80年代，Greenburg等[3]通过体外研究实验发现，在胶原凝胶的条件下晶体状上皮细胞生成伪足，继而转化为间质细胞，由此提出EMT的概念。EMT可发生于生理条件，也可以发生于病理状态。根据研究可以将EMT分为3型：Ⅰ型EMT出现在组织和器官的发育过程中，Ⅱ型EMT则与创伤、修复、预后、组织再生和器官纤维化的过程相关，Ⅲ型EMT发生于肿瘤复发和转移中[4]。3种类型的EMT的共同细胞基质包括细胞形态改变，与基膜的分离作用，丧失极性，黏附性下降，侵袭能力，细胞迁移能力和抗凋亡能力提高，分解产物的增加[5]。

传统的层次模型认为，肿瘤干细胞处于以单向分化的形式产生非干性肿瘤细胞。然而分化的肿瘤细胞也可通过一些调控机制如肿瘤微环境分子调控和EMT，最终转化为肿瘤干细胞。2003年，Ai-Hajj等[6]首次证实乳腺癌干细胞的表型CD44+CD24-/low。Moral等[7]证实了EMT激活RAS/MAPK通路，诱导CD44+CD24-/low的细胞表型，并且产生了间质细胞标志物，表明EMT在乳腺癌干细胞发生的过程中起着重要作用。有研究还表明，在EMT的过程中，乳腺癌干细胞不仅可以获得抗凋亡的能力和间质表型，还具有不断自我更新和侵袭转移的特性，且CD44+CD24-表型的乳腺癌干细胞水平不断上升[8]。而在正常的乳腺细胞的分化过程中，经历了EMT后，可以分化出更多的CD44+CD24-/low表型细胞，这些CD44+CD24-/low表型细胞的E-cadherin水平降低，波形蛋白、N-cadherin和纤维连接蛋白的水平升高，且还高表达FoxC2、Snail、Twist和Slug[9]。这些都是EMT过程重要的分子过程。EMT介导产生的间质细胞样乳腺癌干细胞具有较高的侵袭力。

2 间充质干细胞(esenchymal stnDmal/Stem cells，MSCs)向乳腺癌干细胞的恶性转化机制

MSCs是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。最初在骨髓中发现MSCs，经过研究了解，MSCs具有多向分化潜能、靶向肿瘤、定向分化、免疫抑制和自我更新等特点，一直受到研究界的重视[10-11]。目前研究已经成熟，骨髓、羊水血和组织中所含有的MSCs最丰富[12-14]。在体外和体内的合适条件下可以将MSCs诱导分化为乳腺、脂肪、骨、软骨和心肌等器官和组织细胞[15]。在连续培养多代后仍然具有多向分化潜能，临床上可用于组织损伤修复，移植物抗宿主反应，一些肿瘤的治疗等[16-18]。但由于MSCs仍然处于未分化状态，其具有较好的可塑性和较长的寿命，因此，更加具有恶性转化的倾向。Golfinopouloss等[19]报道了1例急性白血病的女性患者，在接受乳腺癌患者的骨髓移植后，发生了供体来源的乳腺癌。这种干细胞移植的方法发生了骨髓间充质干细胞的(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的恶性转化。肿瘤微环境中存在着巨噬细胞、免疫细胞和多种高分泌因子、生长因子(如BCSG1、IL-8、TNF-α和EGFR、VEGF等)[20-23]。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC)在这种肿瘤微环境中具有恶性倾向，可向乳腺癌干细胞发生转化。这种肿瘤微环境会激活信号转录与激活因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)发生磷酸化调控相关靶基因，然后通过磷酸化的STAT3调控下游基因c-myc和Bcl-xL的表达，进而参与肿瘤形成以及治疗抵抗[24]。汪玲等[25]研究证实了hUMSCs与人乳腺癌细胞(human breast cancer cells，MCF-7B)共培养2周后，hUMSCs成团聚集生长，排序紊乱，黏附性差，并在基因和蛋白水平上证实显著高表达了下游c-myc和Bcl-xL。这说明存在MCF-7B的肿瘤微环境中，hUMSCs会引发STAT3发生异常磷酸化后结合靶基因，启动下游的c-myc和Bcl-xL等肿瘤的基因靶点，导致出现hUMSCs异常增殖，凋亡较少，细胞周期发生紊乱等表现出肿瘤干细胞的特性。

3 乳腺癌干细胞自我更新的通路

3.1 Notch信号通路乳腺癌干细胞分化增殖的信号途径有很多，最重要的3条途径是Notch、Hedgehot和Wnt。这些信号转导通路是乳腺干细胞正常自我更新的途径，在乳腺癌发生发展过程中起着重要作用。

Notch在正常乳腺和良性乳腺疾病中都可以表达，但是在乳腺癌中表达更高，同时浸润性导管癌的表达率会比浸润性原位癌高。Notch信号通路是一条影响细胞自我更新与分化中最重要的途径，Notch通路不像其他通路一样需要第二信使的参与，Notch信号通路的激活仅由Notch受体与邻近细胞表面的配体直接接触实现。目前“三步蛋白水解模型”已经被广泛接受，在乳腺癌干细胞的增殖、分化和凋亡中发挥着重要作用，Notch信号通路中包括着Notch受体、Notch配体以及细胞内效应器分子CSLDNA结合蛋白3部分[26]。Notch是一种单跨膜蛋白，共有4种Notch基因，对应有4种Notch受体，分别为Notch1～4。Notch1与乳腺癌干细胞的自我更新和分化联系密切，沉默的Notch1反而可以使乳腺癌干细胞生长停滞甚至促进其凋亡，并有效地减少乳腺微球体形成单位。且有研究指出，Notch1阳性表达率的高低与乳腺癌的预后有关，分化越低，分期越晚，有淋巴结转移的乳腺癌中Notch1的阳性表达率越高，预后越差[27]。Notch2与雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性的Luminal型乳腺癌干细胞形成密切相关。有研究表明，Notch3受体水平升高，乳腺癌干细胞的比例也会相应升高，在人类祖细胞向乳腺癌干细胞转化中起着重要作用[28]。Notch4主要存在于乳腺基底导管上皮中和乳腺癌干细胞富集的细胞群中。Notch通路的分子标志物的检测可以初步为临床提供理论依据。

3.2 Hedgehot信号通路Hedgehot基因最早是由Nusslein-Volhard等[29]在果蝇突变基因中发现，后来证实在脊椎动物中也存在此基因。Hedgehot(HH)信号通路是由HH配体(Sonic Hedgehot、Desert Hedgehot和Indian Hedgehot)、受体蛋白(Ptch1、Ptch2)、跨膜蛋白(Smo)和核内转录因子GLI以及其下游的靶基因等构成。

3种HH配体功能基本相同，但是在人体发育过程中空间和时间上会表现出差异。受体蛋白是Patch一种12跨膜受体蛋白，与HH配体具有很强的亲和力，参与Hedgehot信号通路的下游基因调控，同时也受下游基因核内转录因子的调控。核内转录因子是一种锌指结构转录因子。在正常的生理条件(没有HH配体)下， Patch抑制Smo的活性，使Smo限制在囊泡中，蛋白酶加工水解下游核内转录因子GLI(GLI2/GLI3)蛋白的C-末端转录激活结构域，变成了转录抑制因子。在有HH配体的情况下，HH配体与Ptch结合，Smo的活性蛋白不受抑制，Smo与下游的核内转录因子GLI1结合，激活Hedgehot信号通路。Wang等[30]研究发现，在乳腺癌干细胞中，高水平表达Patch、Smo、GLI1，靶向药物阻断Hedgehot信号通路后，乳腺癌细胞的成球能力减弱。乳腺癌细胞经过紫杉醇类药物治疗后，Hedgehot信号通路被激活，乳腺癌干细胞的数目比例增高[31]。Lu等[32]研究发现，在用盐霉素诱导乳腺癌干细胞凋亡时Smo和下游核内转录因子GLI的表达下调。

3.3 Wnt信号通路Wnt信号通路是由Wnt蛋白、Frizzled(Fz)、E-cadherin、β-catenin、GSK-3β、Dsh、抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)、Axin、Tef/Lef、Ub等组成。在正常的生理条件(没有Wnt)下，细胞质内的APC、Axin、GSK-3β和CKI与新合成的β-catenin相互作用，结合成Axin-APC-GSK-3β复合物。在存在刺激因素的条件下，β-catenin会与Axin-APC-GSK-3β复合物分离，易与细胞核内的Tef/Lef转录因子结合，激活靶基因，导致正常乳腺组织超长增生，Wnt信号通路的异常激活会使乳腺干细胞异常增殖，转化为乳腺癌干细胞，致瘤性增高。

4 总结

乳腺癌干细胞的发现是乳腺癌发生、易复发、转移、耐药、影响患者寿命的重要因素。本研究通过探讨乳腺干细胞EMT、再生、间充质干细胞向乳腺癌干细胞恶性转化的机制和体内异常激活Notch、Hedgehot和Wnt三条乳腺癌干细胞自我更新的通路，认识到乳腺癌干细胞更新的条件，同时也为乳腺癌的靶向治疗方向提供理论指导。