无创产前检测在双胎妊娠染色体非整倍体异常中的临床研究

杨远强

无创产前检测(non-invasive prenatal testing,NIPT)是运用高通量测序技术对孕妇外周血中游离的胎儿DNA 片段(cell-free fetal DNA,cff-DNA)进行扩增分析,得出胎儿发生染色体非整倍体异常的风险率［1］。在单胎妊娠中,有文献提出,NIPT 检测21、18、13 三体的灵敏度分别为99.0%～100.0%、96.8%～99.9%、78.6%～98.9%,假阳性率0.08%～0.20%,相比血清学筛查具有更高的灵敏度及更低的假阳性率［1,2］,因此NIPT 也被认为是一种更早期、安全、快速、准确的检测方法。近年来,随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)的发展,双胎妊娠在人群中的比例大大上升［3］。随着高通量测序技术在产前筛查的广泛应用,NIPT 为双胎妊娠胎儿染色体非整倍体异常的检测提供了新的可能。本研究旨在探讨利用NIPT 检测双胎染色体非整倍体异常在临床应用中的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014 年1 月～2017 年12 月在江门市中心医院产科(产前诊断中心)就诊,经过充分告知后,自愿接受NIPT 检查,并签署《无创产前检测(NIPT)知情同意书》的双胎妊娠孕妇,共762 例。利用彩超检查胎膜与胎盘的连接判断双胎的绒毛膜性质,结合胎儿的头臀径确定胎龄。

1.2 材料和方法

1.2.1 样本采集 抽取5 ml 孕妇的外周静脉血,置入EDTA 抗凝管,8 h 内经过二步分离法获得血浆,于-80℃的冰箱内进行保存,由深圳华大基因公司收取标本,进行血浆游离DNA 的提取,文库构建和测序等工作。

1.2.2 双胎NIPT 检测的生物学信息分析 通过深圳华大公司研发的生物学信息分析系统,分析数据,通过计算Z 值评估胎儿染色体非整倍体异常的患病风险,截断值为∣Z∣=3。∣Z∣＞3 提示高风险,即胎儿染色体的非整倍体异常的风险高,需要进一步通过侵入性产前诊断明确。∣Z∣≤3 提示低风险,即胎儿的染色体非整倍体异常的可能性较低,需要临床跟踪随访。

1.2.3 验证诊断 利用侵入性产前诊断进行染色体核型分析是诊断胎儿染色体异常的金标准。当NIPT 提示高风险时必须行核型分析以明确诊断；提示低风险者孕期规律产检,产检过程中出现超声检查异常等不良情况,在征得孕妇及家属同意后,安排侵入性产前诊断以明确诊断；对妊娠过程中引产或胎儿丢失者建议取胎儿组织行染色体或基因芯片检查；活产新生儿出生后常规行体格检查,特殊体征者在征求其父母同意并签署同意书后补充新生儿的染色体核型分析。

1.2.4 随访 通过本院电子病历系统或电话回访了解所有孕妇的妊娠结局。随访内容包括胎儿或新生儿是否有特殊面容表现,以及有无流产、引产、减胎,分娩孕周、新生儿出生时健康状况、体格检查结果及有无其他临床诊断和(或)遗传学诊断的异常。所有信息做好整理,并输入电脑系统登记。

1.3 观察指标 分析NIPT 对双胎妊娠染色体非整倍体异常的检测阳性预测值及假阳性率。

2 结果

762例样本中,其中1 例NIPT 提示T18 高风险,孕妇及家属拒绝行产前诊断,产后新生儿外观未见异常,孕妇及家属拒绝行新生儿核型分析,故未纳入统计。最终入选病例761 例。其中单绒毛膜双胎26 例,双绒毛膜双胎735 例。孕妇年龄为(30.63±4.18)岁,孕妇取样的孕周为(14.89±3.06)周。17 例样本因母血胎儿游离DNA 浓度偏低,需重新抽血检测,重采率2.23%(17/761)。重采样本中,15 例低风险,2 例高风险,其中1 例13 三体高风险,1 例18 三体高风险,阳性率为11.76%(2/17)。

NIPT 结果显示,共757 例低风险,随访未见漏诊、误诊。4例高风险,均为DCDA,其中2例21三体高风险、1 例18 三体高风险、1 例13 三体高风险,阳性率为0.53%(4/761)；行侵入性产前诊断染色体核型分析,结果提示有3 例与NIPT 结果一致,双胎之一染色体非整倍体异常,其中2例21三体综合征、1例18三体综合征,1 例未见异常,行选择性减胎术,正常胎儿均存活至足月分娩。NIPT 对双胎妊娠染色体非整倍体异常的检测阳性预测值为75.00%(3/4),假阳性率为0.13%(1/758)。

3 讨论

近年来,随着ART 的发展,双胎妊娠的比例逐步上升。相关研究指出,与ART 相关的双胎妊娠比例约为20%,远高于正常受孕的1.6%［3］。由于孕妇接受ART 的周期普遍较长,这导致了高龄产妇的比例升高；此外,接受ART 的夫妇中双方或任意一方存在染色体异常的比例也更高,试管婴儿的染色体异常比例要明显高于正常受孕胎儿［3］,这导致了双胎妊娠中至少一胎染色体异常的几率要高于单胎妊娠。研究表明,双胎妊娠的染色体异常、组织结构异常的发生率约为0.6%,而合并胎儿发育异常的双胎妊娠中约8.0%～11.5%的病例至少一胎存在染色体异常,尤以21三体综合征最为常见［4,5］。

相关研究表明,ART 可能导致孕妇的生物标记物表达发生改变,因此传统的血清学筛查对双胎妊娠染色体非整倍体的检出率较单胎妊娠更低,假阳性率更高,尤其对于中孕期的单绒毛膜双胎妊娠,血清学筛查的检出率明显比单胎妊娠低,假阳性率高达5%～15%［4,5］。这意味着接受血清学筛查的双胎孕妇,需要做进一步的侵入性产前检测进行确诊。单合子双胎染色体核型多是完全相同的,在产前诊断时只需要进行一次穿刺,即可诊断两个胎儿的染色体核型,而双合子双胎则需要对两个胎儿分别进行穿刺。但也有文献指出,由于单合子分裂后的染色体不分离等因素影响,单合子双胎也可能存在不同的染色体核型,而应该分别对两个胎儿进行穿刺［6］。相关文献指出,单胎妊娠行产前诊断的胎儿丢失率为0.11%～0.85%［7］,而双胎妊娠产前诊断的风险更高：双胎妊娠中接受侵入性产前诊断的胎儿丢失率约为1.8%～3.5%,至少一胎丢失的风险超过单胎妊娠接受侵入性产前诊断风险的2 倍以上［5］。因此双胎妊娠的孕妇接受侵入性产前诊断时,往往承受着巨大的心理压力［4］。此外,不少双胎妊娠为高龄妊娠,或者珍贵胎儿,孕妇及家属希望接受更安全、高效的检测手段［5］。随着高通量测序技术的发展,越来越多双胎妊娠的孕妇选择NIPT,这大大的降低了侵入性产前诊断的比例［8］。

本研究中,利用NIPT 对双胎妊娠胎儿染色体非整倍体检测的阳性率为0.53%,阳性预测值为75.00%(3/4),假阳性率为0.13%(1/758),这与国际上对双胎妊娠的相关研究数据基本一致［2］,相较血清学联合筛查,有着更高的阳性预测值和更低的假阳性率,与多项针对单胎妊娠的研究数据相近［2］。

本研究有2.23%的样本需要重新采集进行检测,相关研究也有类似的检测失败的报道［9,10］。最常见的原因在于cffDNA 在母血中的浓度过低［9］。数据表明,为了得到准确的结果,要求cffDNA 的浓度至少要达到4%［9,10］。cffDNA 在母血中的浓度,与妊娠的周数呈正相关［10,11］,而与孕妇的体质量呈负相关［9,10］。因此,在进行NIPT 的检测时,建议12 周后是最佳的检测孕周［11］,对于过度肥胖的孕妇,在接受NIPT 之前,应充分告知检测失败的可能,并适当推迟取样的孕周。除了母体因素之外,胎儿染色体也是导致cffDNA 浓度不足的主要原因之一。Suzumori 等［12］研究发现,21 三体的胎儿DNA 比例与整倍体的相当,但18 三体和13 三体的胎儿DNA 在母血中的比例明显低于整倍体。本研究也出现了类似的情况,重采病例的检测阳性率11.76%较总体样本的0.53%高。因此,在提示检测失败的病例中,后续的观察应更加警惕胎儿有无组织结构异常,排除胎儿染色体非整倍体异常,以免漏诊。

本研究不足之处在于并未能对病例划分出自然妊娠组与ART 组进行对照,主要由于孕妇基本信息的记录不完善所致,在以后的研究中可以对其作进一步的完善和研究分析；此外,由于样本量较少,可能影响统计评估,在后续的研究中,可以开展多中心的前瞻性研究,更好地探讨NIPT 在双胎中的应用。

总之,NIPT 在双胎妊娠胎儿染色体非整倍体的产前筛查中有很好的应用价值,推荐作为首选的检测方法。