发酵技术炮制胆汁相关方药传统工艺概述

裴育莹 程发峰 谭令 黄御璋 王庆国

发酵是指用微生物分解有机物质的过程。中国传统发酵技术已绵延4000余年，酒、醋、酱、豆豉等都是这一技术的精华。《春秋纬》曰“麦阴也，黍阳也，先渍麴而投黍，是阳得阴而沸，故以麴酿黍为酒”，为制曲酿酒之法。发酵法一直是中药炮制方法之一，从中药发酵的发展史来看，其与传统食品发酵同出一辙，有些中药甚至食药兼用。药用胆汁多来源于动物猪、牛、羊、鸡等，现有很多中药结合胆汁进行发酵，经胆汁发酵可转变药性、降低毒性、提高中药有效成分的含量以增强疗效、产生新的有效成分以扩大中药应用范围。正如《本草正》云：“治小儿急惊，实痰实火壅闭上焦，气喘烦躁，焦渴胀满。胆南星，七制九制者方佳，较之南星味苦性凉，故善解风痰热滞。”李时珍《本草纲目》在论述黄连中提到：“治本脏之火，则生用之；治肝胆之火，则以猪胆汁浸炒。”

1 胆汁生理功能

胆汁具有乳化食物脂类，促进其消化吸收的作用，且作为排泄液可将某些非营养物质特别是生物转化产物排出体外，还具中和胃酸的作用。胆汁酸(bile acid,BA)是胆汁的主要成分，由肝细胞内的胆固醇合成，在许多生化过程中起关键作用[1]。BAs还作为信号分子，诱导某些基因反过来调节胆汁酸的合成、运输、摄取和代谢[2]。胆汁中的初级胆汁酸与次级胆汁酸以钠盐或钾盐的形式存在，在促进脂质消化和吸收中起关键作用。胆盐通过促进脂肪酶/副脂肪酶复合物在脂/水界面的吸附来促进酶催化的脂解作用，并将不溶性脂解产物从界面解吸出来，将其转化为混合胶束，运送到肠粘膜并被吸收[3-4]。

2 胆汁药用功效

鸡胆的药用始见于《名医别录》，鸡的胆汁味苦微寒、无毒，有祛痰平喘止咳、清热解毒、明目、镇静之功效，传统用于小儿百日咳、气管炎、肺炎、外感所致之咳嗽，疗效确切[5-6]，王玥[7]发现鸡胆汁外源体(Exosomes)具有促进肝脏CD4+T淋巴细胞增殖的作用，并且一定剂量的Exosomes具有抗J亚型禽白血病病毒(ALV-J)的作用；猪胆汁具有清热、解毒、滋阴润肺之功效，对多种呼吸系统疾病等均有较好的疗效，张中泉等[8]发现猪胆汁乙醇提取物对痢疾杆菌、肺炎球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均有显著抑制作用；在对羊胆汁中的有效成分牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠的研究中显示，其均能明显抑制前列腺素、一氧化氮和白介素6等炎性介质, 从而对急慢性炎症产生明显的抑制作用[9]；兔胆汁具有降低胆固醇、降低血压的作用，同时还具有一定的解热、抗炎及利胆作用；蟾蜍胆汁具有良好的解热、镇咳及利胆的功效。

3 体外培育牛黄相关研究

牛胆汁首载于《神农本草经》，列为中品。牛胆汁对中枢神经系统、呼吸系统及循环系统有镇静或麻醉作用，可用于治疗消化不良及便秘[10]。牛黄即牛的胆结石，又名“土精”“丑宝”，最早载于《神农本草经》，列为上品，具有化痰开窍，凉肝熄风之效。《中国药典》2015版规定，天然牛黄按干燥品计算，含胆酸不得少于4.0%，含胆红素不得少于25.0%[11]，但天然牛黄成石率仅为1～2%[12]，药物匮乏，价格昂贵。

3.1 发酵技术炮制体外培育牛黄

上世纪70年代，一些医药人员进行人工牛黄的研究，应用牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、胆红素、牛磺酸素等配制而成的粉末，但其成分、结构、含量等均与天然牛黄相差甚远；后中国多地医药工作者利用活牛胆囊，在其内培植牛黄，但手术复杂，产量低，质量不稳定。2000年后相关科研单位进行体外培育牛黄，在牛胆汁中加入一定量大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或其组合菌液，对牛胆汁进行细菌发酵处理，随后利用发酵牛胆汁和澄清饱和钙盐制取有效成分的沉淀物，根据药用要求加入适量的胆红素、胆酸、去氧胆酸和无机盐，制作出复合胆红素钙；最后利用复合胆红素钙和发酵牛胆汁在体外培育牛胆结石[13]。用该方法使生产周期更短，效率更高，精确地控制了反应条件，保证了培育牛黄质量稳定均一。

3.2 三种牛黄成分鉴别

胆汁酸和胆红素是天然牛黄的主要活性成分，同时也是牛黄中含量最高的成分。张宇静等[14]建立超高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定三种牛黄中胆汁酸类成分含量，发现猪去氧胆酸是人工牛黄的特有成分，胆酸和去氧胆酸在体外培育牛黄中含量丰富，天然牛黄中胆酸、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、去氧胆酸4种胆汁酸含量丰富。雷凯等[15]通过建立HPLC-MS/MS法测定证实了虽然天然牛黄(cow bezoar,CB)比体外培育牛黄(CBS)总胆汁酸含量少，但CB中的结合胆汁酸多于CBS。有相关研究报道[16]肠道内的微生物群落改变胆汁酸池，从而在一定程度上导致或减少疾病的发生，由此推测牛黄类药物中结合型胆汁酸含量可能与牛黄类药物的某些疗效有相关性。

3.3 体外培育牛黄现代药理研究

3.3.1 解热镇痛抗炎作用 有研究表明[17]体外培育牛黄可显著抑制酵母所致大鼠发热及伤寒副伤寒三联疫苗致家兔发热，其解热作用强度与牛黄相似。张韶辉等人[18-19]以蟾蜍坐骨神经干和三叉神经节细胞为标本，实验中发现不同浓度的体外培育牛黄可剂量依赖性地抑制三叉神经节细胞细胞膜上总钠及钙通道电流，此可能为体外培育牛黄发挥镇痛作用的机制。体外培育牛黄可显著抑制急性炎症的渗出和白细胞趋化，降低相关炎性因子的释放以及炎症的瀑布效应等[20]。

3.3.2 中枢神经系统作用 张新奇等[21]研究显示体外培育牛黄能通过改善患者脑部缺血状态，同时降低机体耗氧量，促进脑部血液循环，增加血管弹性从而促进脑中风患者意识的恢复。有研究表明[22]体外培育牛黄可明显延长缺氧小鼠存活时间，减轻脑组织的病理损伤。且体外培育牛黄可以减轻海人酸致痫大鼠的神经病理学改变，保护海马结构的神经元[23]。

3.3.3 心血管、呼吸、消化系统作用 基于小鼠动物实验研究表明[24]，体外培育牛黄可对心肌缺血-再灌注损伤起到明显的保护作用，其机制可能与抗自由基损伤有关。刘灵等[25]研究表明体外培育牛黄可以降低炎症因子-17水平，以减轻炎症反应，并可减少肺组织中Caspase-3表达，有抑制大鼠肺泡上皮细胞凋亡的作用。周凤蕊等[26]对74名黄疸型肝炎患者进行临床研究，结果发现体外培育牛黄可改善患者肝功能，提升临床疗效。有研究表明[27]体外培育牛黄可降低慢性溃疡性结肠炎小鼠的疾病活动指数，同时减轻了结肠的组织病理损伤。

3.3.4 抗肿瘤和抗衰老作用 汪世元等[28]通过体外实验发现体外培育牛黄能诱导人肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡，认为体外培育牛黄具有抗肿瘤作用。体外培育牛黄还可降低老年小鼠心、脑组织的脂褐素、MDA含量，提高SOD活性，提高老年小鼠生存率，具有抗衰老作用[29]。

4 胆南星古今炮制演变与分析

天南星在中国拥有两千多年的用药历史，其味苦、气味辛，性温，有毒，临床用于顽痰咳嗽、风痰眩晕、中风、口眼涡斜、惊风等疾病的治疗，有祛风定惊、燥湿化痰、消肿散结的功效。天南星有很多炮制品，胆南星为其炮制品之一。天南星有大毒，用胆汁炮制后可降低其毒性，胆南星常用于痰热咳嗽、中风痰迷、癫狂惊痫等症。

4.1 胆南星的炮制演变

胆南星最早见于宋代《圣济总录》，用胆汁制南星最早记录于宋代《小儿药证直决》即采用牛胆汁制备天南星——“腊月酿牛胆中阴干百日”。《太平惠民和剂局方》所创牛胆汁制饼法“汤洗，焙，为末，用牛胆汁和作饼，焙干”，被认为可能是现今部分地区炮制胆南星方法的起源。元明年代沿用了前人的炮制方法，而且对制作工艺如炮制时间、胆汁品质等进行了更为详细的记载，如《丹溪心法》中提到“须用黄枯牛胆，腊月粉南星亲手修合，风干，隔一年用。牛胆须入三、四次者佳”。《本草纲目》中有造胆星法：“以南星生研末，腊月取黄枯牛胆汁，和剂纳入胆中，系悬风处干之，年久者弥佳。”清代以后除沿用前法，更是有九制胆星法、酒蒸胆星法和桃仁牛胆共制法[30-32]。现代炮制胆南星多采用发酵法和混合蒸制法，其中发酵工艺目前无统一规范，有报道称发酵的胆汁种类和时间是炮制胆南星的直接因素，影响胆南星的功效[33]，所用胆汁有牛胆汁、羊胆汁、猪胆汁，发酵时间从24小时至数月不等。目前广泛使用的发酵法是按照《全国中药炮制规范》，取生天南星粉末，加入净胆汁(天南星∶胆汁=1∶4)，多数为猪胆汁(或猪胆膏)，搅拌拌匀，放温暖处，发酵7～15天后，再连续蒸或隔水炖9昼夜，每2小时搅拌1次，除去腥臭气，至呈黑色浸膏状，口尝无麻味为度，取出，晾干，再蒸软，趁热制成小块[34]。也有将生南星研成细粉后，置釉缸内，胆汁分3次放入，第1次加入后蒸制，第2次入后日晒夜露发酵，再次进行蒸制，第3次加入胆汁，再发酵至色泽变黑，无腥臭气[35]。

4.2 发酵法制胆南星成分分析

王微等[36]通过小鼠生理生化指标发现，生南星的热性可使小鼠的饮水量、耗氧量、Na+-K+-ATPase活力、肝脏组织总蛋白含量增加，而胆南星的寒性可使小鼠的饮水量、耗氧量、Na+-K+-ATPase活力、肝脏组织总蛋白含量降低，进一步验证了“牛胆汁转天南星之温热之性而为寒凉”的理论。陈云等[37]采用 HPLC-ELSD检测发酵制胆南星炮制品中的胆汁酸类成分的含量，结果发现发酵制胆南星中可检出游离型胆汁酸类成分猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸，未见有结合型胆汁酸类成分，故在胆南星发酵过程可将胆汁中的结合型胆汁酸类成分转化为游离型胆汁酸。陈江宁[38]通过对胆南星发酵前后多类成分对比，发现胆南星发酵前后胆酸类成分有明显的变化规律，即发酵后结合型胆酸转变为游离型胆酸，且游离型胆酸的含量与发酵时间、胆汁加入量密切相关。李瑶[39]运用PCA统计发酵制胆南星与原料的相关数据结果发现天南星胆汁发酵前后有170个显著性差异成分，其中增加成分有118个，28个成分来自猪胆汁，其余均为炮制过程中所生成的新成分。

5 化风丹药母炮制及研究进展

化风丹是贵州省传统名药，1951年被列入国务院保护的四大名药之一，2008 年入选国家级非物质文化遗产名录[40]。具有熄风镇痉，豁痰开窍功效，可治疗癫痫、中风偏瘫疾病，还可用于治疗风痰闭阻、面神经麻痹、口眼歪斜等疾病的药物。

5.1 化风丹药母的炮制

化风丹的制备为药母的制备和成药的制备两部分，其中药母制备取处方中生川乌、生半夏、生天南星、白附子、郁金、神曲粉粹成细粉，加入牛胆汁混合均匀，置于密闭容器中，在温度20～40℃，湿度50%～80%的条件下发酵30～35天，取出，干燥，即得；牛胆汁应具备条件：PH=6.0～8.0，密度0.8～1.3，固形物：0.02～0.25，胆酸含量：8.0～45.0 mg/mL[41]。对于药母的干燥工艺，曹国琼等[42]以药母总生物碱含量为指标采用紫外分光光度法，结合其外观性状和含水量，比较自然阴干、烘干、减压干燥和微波干燥4种处理方法对化风丹药母外观性状和内在质量的影响，最终综合各项指标化风丹药母干燥方法宜采用60℃减压真空干燥4.5小时。

5.2 化风丹药母研究

曹国琼等[43]通过建立高效液相色谱法同时测定化风丹药母中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱含量，发现在发酵炮制后3种双酯型生物碱含量明显降低。现代药理研究表明，双酯型生物碱是川乌中的毒性成分，临床生用具有很大的危险性，而其经炮制后分解为单酯型生物碱，毒性降低了1/200[44]。向文英等[45]对化风丹血清药物化学进行研究，在负离子模式下含药血清中共发现8个药源性成分(其中3个为原型成分，5个可能为代谢产物)，有6个来自药母；在正离子模式下含药血清中共发现9个药源性成分(其中2个为原型成分，7个可能为代谢产物)，有6个来自药母，初步确定了化风丹入血成分主要来自药母。

6 总结与展望

随着现代医药领域和科技的发展，中医药在疾病的预防和治疗方面越来越受到国际医疗市场的认可，传统中医药的开发创新将会成为新趋势，将发酵技术应用于中药制剂研究和新药开发，将会成为中药现代化的重要手段。卫生部药品检验所动物实验结果发现：发酵中药只需1/28的量便可与传统中草药煎、煮、熬水提物一份的量等效。胆汁作为一种溶剂，在中药发酵中有着独特的优势和特有的功效，王静等[46]比较黄连、胆黄连及其水煎液中生物碱类成分的含量，结果发现黄连水煎液、胆黄连水煎液中总生物碱的转移率分别为71.17%和78.50%，表明了黄连经猪胆汁炮制后能够增加生物碱类成分在水煎液中的溶出，进一步阐明了胆黄连寒性增强的炮制机制。将胆汁发酵技术应用于中药炮制为中医药的研究与开发开辟了新的空间，但胆汁发酵技术仍存在大量问题有待研究解决，一是要对中药传统发酵工艺深入研究，选择合适的中药进行胆汁发酵，探究中药发酵过程的生化反应机理及活性成分，实现发酵产物的有效控制；二是选择发酵过程中所需要的菌种，鉴定发酵过程中的优势菌种，揭示不同菌群之间的功能关系；三是需摸索发酵条件以便提高生产效率。随着中药发酵技术的深入，选择更为合适高效的原料显得尤为重要，胆汁发酵能产生更多的药用功效及更广的药用范围，为中医药资源的保护与利用提供新方法。