DNA甲基化的表观遗传机制及其在动物遗传育种中应用

于 翔，王晨柳，文逸凡，张子敬，吕世杰，王二耀，黄永震*

(1.河南省动物卫生监督所，河南 郑州 450003；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；3.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 45002；

1 DNA甲基化概述

表观遗传是指在碱基排序顺序没有改变的前提下所发生的外部表型特征和内部生理生化特征的改变，同时这种改变是可遗传给后代的。DNA甲基化是表观遗传的一种重要形式，而在动物机体内，其他形式的表观遗传还包括组蛋白修饰、非编码RNA和染色质重塑。在真核生物中，常常需要借助DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)来完成甲基化的甲基转移过程，被转移的甲基基团来源于S-腺苷提供甲硫氨酸，整个反应最终使DNA分子上CpG二核苷酸位点的胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶(5-mC)，完成DNA分子的甲基化。

在哺乳动物中，参与甲基化修饰过程的转移酶主要是DNMT1和DNMT3(DNMT3a、DNMT3b)。前者发挥其功能，负责维持现有DNA的原有甲基化状态；后者则在DNA重新甲基化发挥其功能，在细胞分化发育早期参与DNA共价修饰过程。而近年来，越来越多的研究表明，由DNA甲基化所引起的表观遗传对于动物的抗病性能[1]、生长发育[2-3]、繁殖性能[4]等方面均有重要的影响，因而相关位点的甲基化可作为分子标记，应用于未来的动物育种之中，本文将对此进行综述。

2 甲基化与动物抗病性

动物抗病性是动物免疫功能的外在体现，分为两个方面，包括动物体对病原侵入的忍耐能力和缩短病原的生活周期、抵御其带来损伤的能力。抗病性在不同动物个体之间具有较大的差异，但能稳定遗传给后代[5]。动物免疫机制可分为两大类，包括体液免疫和细胞免疫。而在细胞免疫过程中，成熟T淋巴细胞发挥着清除病原的重要作用。根据表面标志的不同和细胞功能的差异，T淋巴细胞又可细分为CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。CD4+辅助T细胞是一类非常重要的免疫细胞，它不仅在辅助CD8+T细胞发挥其功能的过程中扮演了重要角色，自身产生和分泌细胞因子也能够使机体的免疫应答过程得到进一步的强化，细胞本身对于侵入机体的病原还具有不可忽视的杀灭和清除的功能[6]。

在实验中发现，在因感染金黄色葡萄球菌而出现乳房炎的牛群中，体内CD4+T细胞的数量出现了较大的增长，结果远高于未感染牛群，增长的CD4+细胞进而导致CD4+/CD8+T细胞的比值也出现了显著下降[7]。而因在感染链球菌而患有乳房炎时这两种免疫细胞则呈现出同步增长的趋势。在一例针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究中也发现，在以病毒入侵为始，病毒感染宿主猪的不同时期中，猪体内的CD4+T细胞的数量呈现出了一个动态的变化过程[8]。而在对于复发性葡萄膜炎发病过程的研究中，马对于该病的自发免疫能力也与CD4细胞膜蛋白组丰度显著相关[9]。

而CD4基因与T淋巴细胞的分化和成熟密不可分，不同的表观修饰会对T细胞的分化过程产生非常重要的影响，而CD4基因上的特性DNA位点的甲基化则与CD基因表达存在明显的相关性[10]。研究发现，CD4基因的第一外显子持续不断的发生去甲基化时，对于CD4基因的整体表达能够起到促进作用，同时也促进了双阴性(Double—negative，DN)细胞发育为双阳性(Double—postive，DP)细胞。在这个转化过程中，该基因的甲基化程度经历了一个先升高再降低的过程[11]，随后完成转化的双阳性细胞继续发育为CD4单阳性(CD4 single—positive，CD4SP)T 细胞[12]，继续发挥其免疫功能。

研究还显示，DNA甲基化与炎症的发生也存在一定的关系[13]，甲基化能够对炎症反应产生一定的调控作用。机体内部分炎性因子启动子区域内的甲基化水平能够对炎性因子的总表达量产生不可忽视的影响作用；另外，某些炎性因子也能够通过干扰甲基转移酶，使其过量表达，从而导致DNA分子出现异常甲基化[14-15]。尽管在某些疾病中，DNA甲基化如何参与调控炎性因子的机制得到了初步揭示，发现了甲基化在调控炎症的过程中的部分信号通路和调控途径的作用过程，但仍有大量的调控机制有待于之后更深入的研究和解析。

近年来频发的大规模流行疾病对畜牧业造成的损失巨大，加之在对牛、羊、猪等家畜的抗病性能评估上发现，家畜本土品种的抗病性能显著优于目前分布较广、数量较多的培育品种[16-18]，因而开展了对家畜抗病性能遗传基础的研究热潮。通过研究CD4基因的多态性和表观遗传进展，目前已经在牛、猪上阐明了CD4基因甲基化对于乳房炎等几种特定疾病的抗病机制，但对于甲基化提高一般抗病力的研究以及应用于分子育种方面的研究尚不明确，也不深刻。且甲基化与抗病性能的研究多集中于牛、猪等家畜，对于羊等其他家畜的相关研究较少，期待后续更全面、更深入的研究。免疫相关基因的甲基化能够作为动物抗病育种的分子理论基础，再结合现代分子标记技术，将能够大幅度提高抗病育种效率，培育出更好优良的抗病家畜品种。

3 甲基化与动物生长发育

3.1 甲基化对肌肉发育的影响

动物的肌肉的发育是一个非常复杂的过程，位于中胚层的祖细胞，需要经过增殖、分化、融合及成熟等一系列的变化，最终才能形成肌纤维，完成肌肉发育。而在这个不断变化的过程中，动物体内相关基因的甲基化状态也呈现出了动态的变化趋势，其过程十分复杂。细胞分化使细胞整体的甲基化状态上升[19]，但在某些特殊位点上却出现了下降。而研究发现，在骨骼肌细胞的形成过程中，是与其他组织或细胞的DNA甲基化模式存在有明显差异的。Calvanese等发现在骨骼肌细胞能存在有至少178个特异的高甲基化位点[20]。Tsumagari等也通过比较发现在这些差异化位点中，有94%在肌肉中都表现为低甲基化，在成肌细胞或肌管细胞能够发现的相同的位点占到了47%[21]。而肌肉的生长发育，与这些特异化的甲基化位点具有密切的关系。在这个过程中，两类因子，即生肌调控因子(Myf5、Myf6、MyoD、MyoG)和调控因子上游的Pax3和Pax7等对肌肉具有非常重要而深远的调控作用。通过比较胚胎干细胞、骨骼肌干细胞、成肌细胞及肌管细胞生肌调控因子相关基因的甲基化程度，Carrio等[22]发现，Myf5的增强子区域在胚胎干细胞中，该区域表现为高甲基化，而其他细胞均呈现出低甲基化，这种低甲基化水平使得Myf5基因表达量有所增加。这说明肌肉发育过程的甲基化模式具有一定的时空特异性，在不同生肌阶段，甲基化状态会产生一定的变化，这种甲基化状态的变化能够通过调控不同阶段的基因表达，从而保证肌肉发育的正常进行。

3.2 甲基化对脂肪生长的影响

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是动物体内控制脂肪生成和脂肪组织发育的关键调控因子，同时也会参与糖脂代谢、炎症、免疫反应等多种生理生化过程之中[23-25]。通过使PPARγ基因过表达能够改变细胞分化方向，使非脂肪源性的细胞分化成为脂肪细胞[26]；而敲除 PPARγ基因后则脂肪细胞不能完成分化[27-28]。小鼠实验中，在前脂肪细胞逐渐转化为脂肪细胞的过程中，PPARγ2启动子呈现出了由高甲基化逐渐向低甲基化发展的趋势，而在这一过程中PPARγ2 mRNA的表达量则出现了逐渐上升[29]。在对患有肥胖型糖尿病的小鼠内脏脂肪细胞检测的结果也佐证了这点，其PPARγ2启动子的甲基化高于野生正常小鼠，进而导致PPARγ2 的mRNA表达量下降，因此对脂肪细胞的生成具有促进作用。Sun等[30]在高、低脂双向选择系肉鸡 PPARγ基因启动子6个位点甲基化及PPARγ表达量的实验也证明DNA 甲基化能够调控PPARγ基因的表达和脂肪生成。因此能够把PPARγ基因视为一个遗传标记和表观遗传标记，并将其应用于分子标记育种的潜力巨大，通过对PPARγ基因的筛选，能够在一定程度评定动物个体或品种的生脂能力，进而加快优质低脂畜禽品种培育进展。

4 甲基化与动物繁殖

初情期对于动物生长和畜产品生产是一个非常关键的时期，进入初情期的动物开始逐步获得繁殖能力，其标志是母畜初次发情并排卵、公畜睾丸开始具备分泌和产生有功能的精子。关于初情期是如何启动的，大多数的观点赞成它是受到了多方面因素之间的交互作用的调控，主要的影响因素有遗传、环境、神经内分泌等[31]，其出现时间早晚体现出了不同动物个体之间繁殖性能的相对差异。有研究显示，在初情期的启动过程中，大量的基因通过参与和调控神经内分泌，最终影响了初情期的启动[32-34]。Elks等[35]研究发现，与人类的月经初潮年龄存在有一定关联性的基因变异的数量已经超过了30种。而对灵长目动物猕猴的研究中发现，少年期和成年期雄性猕猴相比，成年猴脑组织的GnRH mRNA 的表达量更大，二者相比较有一个显著增高，与此同时多个相关CpG岛的甲基化状态则表现为显著的降低[36]。在一例向实验动物注射了DNA甲基化抑制剂的对比的实验中，注射了AZA的雌鼠和未注射雌鼠的初情期和性成熟时期出现了明显的差异，注射了抑制剂后，初情期和性成熟时期表现出了明显的推后[37]。在家畜中的研究发现，分别在1、2、3月龄对三元杂交猪(皮特兰X长白猪X大白猪)8个已被证实的睾丸印记基因甲基化状况进行检测，发现这些基因仍然具有一定的活性，机体通过甲基化的形式，对印记基因发挥了一定的调控作用[38]。但甲基化究竟如何对动物繁殖产生影响，这其中的具体机制尚有待于研究阐明，目前在其他家畜上的研究和相关的报道仍然较少，仍需要后期进一步的研究。

5 小结

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传机制，其产生与变化会对动物的表型特征和生理生化特征产生巨大而深远的影响。而目前针对甲基化的研究尚且停留在一个比较初级的阶段，对于甲基化如何对动物产生影响的机制尚有待于进一步研究，应用于动物育种的研究报道也较少。但研究清楚甲基化的内在调控机制和外在表现过程，将有助于为开展分子标记辅助选育奠定扎实的理论基础，进而指导培育高产、抗病、品质优良的新品种，能够更充分的发挥家畜的生产潜力，以得到更高的经济效益。