骨性关节炎相关外泌体潜在诊疗价值的研究进展

李中杰 吴晓敏 潘晓华*

1.广东医科大学，广东 湛江 524000 2.广东医科大学深圳宝安临床医学院/南方医科大学附属深圳宝安医院，广东 深圳 518100

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是最常见的慢性关节疾病，是人类主要的致残原因之一，影响了全球15%以上的人口[1]。最新的流行病学研究表明，中国目前有症状的膝骨关节炎患者高达1.1亿，这将造成重大的社会和经济负担[2]。在发病机制上，虽然目前的研究表明其与细胞因子、信号通路、基质金属蛋白酶及免疫因素等有关[3]，但具体的作用机制仍未十分明确；在诊断上，目前OA诊断标准[4]不适用于早期诊断，有研究[5]发现，在OA早期能观察到关节软骨明显的修复反应，而在中晚期修复效果并不理想，因此早期诊断并及时治疗是关键所在。已知miR-140与软骨细胞分化有关，有研究[6]表明miR-140-3p在膝关节滑液中有表达，并且与OA的严重程度呈负相关，提示miR-140-3p有可能成为膝关节OA早期诊断的候选标志物；在治疗上，关节腔注射皮质类固醇或透明质酸对早期OA具有一定疗效但又存在争议[7]，晚期OA虽然能通过关节置换手术解决，但植入物寿命等问题一直是业界的难题。基于目前对OA发病机制的局限性认知及突破的需要，外泌体作为一种细胞间的通讯介质因可以保护其内容物直接递送至相关细胞发挥作用的特性而开始备受瞩目[8]。如在OA早期，关节腔中的外泌体会介导抑炎因子和miRNA等协助软骨修复，而中晚期则会诱导相关炎性因子及促炎miRNA的产生加速病理改变。

1 骨性关节炎相关的外泌体特点

外泌体(exosomes，exos)是一种直径为30～120 nm双层膜结构的囊性小泡，可远距离膜性转运供体细胞内的生物小分子(核酸、蛋白等)至受体细胞发挥调控作用，它几乎由所有细胞类型分泌，并广泛存在于各种生物体液中[9]。研究显示[10]人类OA关节软骨源的外泌体大小在50～250 nm，并主要富集于钙化软骨和软骨下骨区域，与碱性磷酸酶活性增加相关。它们体内不仅含有病理性钙晶体，还含有低表达的蛋白多糖及各种修饰后的蛋白质。用OA滑膜液(synovial fluid，SF)源的外泌体作用于软骨细胞后，研究[11]显示它们容易被软骨细胞内吞，提示外泌体在OA中潜在一定特异性。在12例OA和非OA患者滑膜液中,发现两组外泌体的大小(OA：0.128 μm、非OA：0.127 μm)和浓度(OA：1.18×1013/L、非OA：1.59×1013/L)无显著统计学意义[11]，但两组间外泌体的miRNA含量有所不同[12]，进一步对其内容物分析发现miR-200c显著增加[12]。已知外泌体的内容物不受内切酶的影响，提示OA外泌体的特异性由其内的miRNA等体现的，因此对外泌体源miRNA更深入的探索将有助于解析其是如何参与或调控OA的病理生理。

2 外泌体作为OA潜在诊疗价值的研究进展

2.1 外泌体与OA病理的相关性

2.1.1软骨及滑膜：OA的发病机制复杂且受多种因素影响[13]。首先，健康关节软骨依赖于软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的维持。软骨细胞负责合成聚集蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)，后者进一步转化为关节软骨。ECM主要由Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖组成，而后者主要由ACAN组成，ECM的合成和破坏是维持关节软骨的重要基础。其次，关节内另外一个重要的组织是滑膜，滑膜由滑膜巨噬细胞和滑膜成纤维细胞[又称成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)]组成，主要负责分泌润滑软骨的关节液。这些不同组织或细胞以外泌体为桥梁从而维持关节内环境平衡或介导OA的发生发展[14]。体外研究发现[15]白介素(IL)-1β所处理的软骨细胞源外泌体会作用于FLS，相较对照组显著增加基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13的表达，同时滑膜上肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β和环氧化酶-2(COX-2)的数量也有不同程度的升高，提示外泌体在OA的炎症过程中起着重要作用。Kato等[16]在FLS与关节软骨细胞之间进行外泌体研究，发现用IL-1β刺激人FLS源外泌体(实验组)在体外实验和体内模型中可以诱导软骨细胞OA样改变，与FLS源外泌体相比，实验组可显著上调软骨细胞MMP-13和血小板反应蛋白解聚素金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs 5，ADAMTS-5)的表达，并下调Ⅱ型胶原纤维α1基因(COL2A1)和ACAN的表达[16]，提示在FLS与软骨细胞之间存在着与外泌体相关的正反馈炎症通路。此外，实验组含有大量的MMP-3、IL-6及血管内皮生长因子，将该外泌体作用于小鼠股骨软骨移植组织，与对照组相比其所诱导的ACAN及血管生成数量更多[16]，通过NanoString分析显示有50种miRNA表达水平存在差异[16]，提示血管的生成可能由FLS刺激软骨基因的表达产生，因此外泌体内miRNA在OA中可能扮演传递通路的角色。进一步分析miRNA差异表达谱发现，IL-1β处理的FLS总共有340种miRNA被上调，而在FLS源外泌体中仅发现11种miRNA被上调，这一研究显示FLS对包装进入外泌体的miRNA具有一定的选择性[16]。值得注意的是，在FLS源外泌体所上调的11种miRNA中，只有5种在FLS内也被上调[16]，分别是miR-4454、miR-720、miR-199b、miR-500B和miR-3154，其中对前三者的研究较为深入。miR-4454参与促进了软骨细胞炎症[17]，miR-720能促进细胞迁移[18]，miR-199b在软骨形成过程中增加，而在间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)衰老过程中减少[19]。以上研究显示外泌体中的miRNA不仅在细胞内发挥调节分子的作用，而且可能影响血管新生进而参与OA的发生发展。

2.1.2滑液：在OA的病理条件下，滑膜组织会产生大量的炎症细胞因子、MMP等破坏关节软骨，进而加速骨性关节炎的发展，而滑液在一定程度上又反映滑膜炎症，因此通过对滑液内容物的研究可能进一步揭示骨性关节炎的病理。Domenis等[20]发现用终末期OA患者滑液源外泌体可以促进外周血单核细胞分化的促炎性M1巨噬细胞产生一系列炎症细胞因子、MMP和趋化因子(CCL)，并认为这是关节软骨炎症及退化的重要因素。Kolhe等[12]也做了类似的试验，发现外泌体所处理组显著降低了关节软骨细胞合成代谢基因(COL2A1、ACAN)的表达，升高了分解代谢和炎症基因(IL-6、TNF-α)的表达，这些研究均表明外泌体在OA的发病中发挥重要作用。此外，他们还发现OA患者滑液外泌体miRNA含量的变化具有性别特异性，女性OA组比男性受到更多miRNA差异调节，两种性别中下调miRNA显示与聚糖降解、细胞粘附分子和黏蛋白型O-聚糖生物合成有关，上调miRNA则与甲状腺激素合成、生物素代谢和苯丙胺成瘾信号传导有关[12]。其中某些miRNAs，如女性骨关节炎患者所下调miR-26a，是雌激素响应性的。与以往的研究相近，雌激素可增加靶向toll样受体TLR3的miR-26a的表达，其雌激素抑制剂可抑制FLS中miR-26a[12]。在OA中，女性的发病率高于男性，其外泌体中的miRNA可能是性别差异发病机制的重要部分。

2.2 外泌体作为OA生物标志物的潜在价值

细胞产生的外泌体可以释放到细胞外(如血液或体液)，它们可以反映亲代细胞的生理或病理状况，并作为不同疾病或疾病不同阶段的潜在生物标志物[21]。

研究[22]显示关节滑膜炎症可能是OA的超早期表现，其发展可能影响OA的进展，从OA滑液中分离的外泌体可刺激巨噬细胞释放一系列的炎症细胞因子和CCL，包括IL-1β、MMP7、MMP12、CCL8、CCL15、CCL20等，其中IL-1β在OA滑膜液中明显升高[20]，有利于其成为生物标志物，而MMP12和MMP7又与OA的严重程度有关[23-24]，对外泌体源MMP的检测可在一定程度上反映OA的进展。此外，在OA的病理条件下，OA滑液外泌体的miR-200c含量较对照组增加2.5倍[16]，提示其可成为潜在生物标志物。在最近的一项研究中，Zhao等[25]将OA患者的血浆和滑液外泌体的lncRNA进行差异基因表达分析后发现，对于血浆样品，所设定三组间(早期OA组、晚期OA组、对照组)外泌体lncRNA的表达没有显著统计学意义；而在滑液组中，其外泌体lncRNA PCGEM 1的表达不仅在OA患者与正常人之间存在差异，而且在OA的不同阶段也有显著差异，由于WOMAC指数与外泌体lncRNA PCGEM 1的表达密切相关并且ROC曲线下面积为0.879，提示滑液外泌体lncRNA PCGEM1可能是区分早期OA和晚期OA的有力指标。

Tsuno等[26]比较了类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、OA患者及健康捐献者血清外泌体的蛋白质谱，结果显示在204个蛋白质斑点中，OA较健康对照组有21个蛋白质点显示出不同的强度，其中有7个的强度差异具有统计学意义。进一步研究显示与RA组相比，ID236(组织蛋白酶F)仅在OA组升高，而ID 325(Igα-2链C区)仅在OA组降低。据报道[27-28]，其家族中另一个成员(组织蛋白酶K)参与OA的发病机制并可作为OA潜在生物标志物，提示组织蛋白酶F可能参与OA的发生发展并有望成为OA外周血液中潜在分子标志物。

2.3 外泌体作为OA治疗的潜在价值

随着精准医疗的提倡，干细胞尤其是MSC疗法备受青睐。研究显示MSC可以通过抗炎、调节免疫、促进组织修复再生等发挥治疗作用，但对其作用的方式却各抒己见，没有一种单一因素能自圆其说。近年来，越来越多的报道表明外泌体可作为MSC旁分泌机制在OA治疗中发挥重要作用[29-30]。目前MSC来源外泌体(MSC-derived Exos，MSC-Exos)的研究大多集中于OA的治疗，动物关节内所注射MSC-Exos可以减轻炎症并修复软骨组织。

Cosenza等[31]将鼠骨髓源MSC-Exos注入胶原酶诱导的OA模型中，发现其可以保护小鼠关节免受损伤，在第42天时，组织切片显示关节软骨中所有参数[体积、厚度、软骨退化(表面/体积比)]显著改善，且外观与健康小鼠相比没有明显差异。体外实验显示这一效应与CD4+和CD8+T淋巴细胞的抑制、B淋巴细胞的活化以及诱导M2样抗炎巨噬细胞的表达有关，而体内研究显示与浆母细胞数量减少和分泌IL-10的Breg细胞增加有关。Zhang等[32]的研究显示在免疫活性大鼠股骨远端软骨缺损模型中，关节内注射人胚胎MSC-Exos可以促进软骨再生。在这项研究中，注射的外泌体加速了新组织填充和增强了II型胶原及糖胺聚糖的合成，到12周时，外泌体处理的实验组不仅较磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)处理的对照组的组织学评分显著改善，而且其表面的软骨和软骨下骨完全恢复并观察到与年龄相匹配的天然组相似的ECM沉积。尽管该研究没有进一步验证外泌体的具体作用，但它证明了MSC-Exos在体内具有促进软骨修复的作用。Wang等[33]进行类似研究，发现关节内注射人胚胎干细胞诱导的MSC-Exos(embryonic stem cell-derived MSC-Exos，ESC-MSC-Exos)减轻了DMM小鼠模型中软骨破坏和基质降解。到术后8周时，组织学结果显示注射PBS对照组的DMM小鼠有严重的纤维化和钙化软骨的侵蚀，而ESC-MSC-Exos组小鼠的纤维化较少，仅向浅层下方有垂直裂缝及少许表面层丢失，并且其最大和总OARSI评分均显著低于对照组。进一步的体外实验显示，这种效应与Ⅱ型胶原合成增加及ADAMTS5的表达降低有关。这些研究都证明了外泌体可以修复动物关节软骨，同时MSC-Exos可作为无细胞疗法治疗OA。

Zhu等[30]比较了滑膜MSC-exos(synovial membrane-derived MSC-Exos，SMMSC-Exos)和诱导多能干细胞来源MSC-exos(induced pluripotent stem-derived MSC-Exos，iMSC-Exos)对OA治疗的有效性，发现注射SMMSC-Exos和iMSC-Exos均能在胶原酶诱导的小鼠OA模型中减弱OA，但iMSC-Exos的治疗效果更优，因此iMSC-Exos可能代表了一种新型OA治疗方法。

目前修饰后的外泌体在OA治疗中也备受关注，miR-140-5p对MSC的软骨分化至关重要，通过基因分析显示SMMSC-140-Exos是miR-140-5p在SMMSC中过表达产生的一种改良外泌体，其可促进软骨细胞的增殖和迁移，但对细胞外基质分泌的影响很小，并可预防大鼠模型发生OA变[34]。Sun等[35]对人骨髓间充质干细胞源外泌体(human bone marrow-derived MSC-Exos，hBMSC-Exos)中miRNA的差异表达分析发现，过表达miR-320c的hBMSC-Exos可促进软骨细胞增殖从而发挥治疗OA的作用，体外实验显示其作用与SOX9的上调及MMP-13下调表达有关。目前的研究显示，各种MSC-Exos或修饰后的外泌体均可促进软骨细胞的增殖从而发挥治疗OA的作用，但其具体作用机制尚未明确，进一步的探索有利于为OA的精准治疗提供新策略。

3 结论与展望

OA的病理涉及软骨、软骨下骨及滑膜等组织，外泌体可作为它们的枢纽发挥传递通路的作用，滑液或滑膜成纤维细胞源外泌体可诱导OA的进展，血清及滑液源外泌体有助于OA的诊断，不同来源MSC-Exos可通过增加软骨细胞增殖、抑制炎症等修复关节或延缓疾病进展。诚然，外泌体的这些作用将极大促进OA机制、诊断及治疗方面的研究，但同时也存在一些难题。首先，外泌体中含有大量的蛋白质及非编码RNA等，虽然它们参与或调控OA的发生发展，但难以准确找到有贡献的分子，因此未来的研究可侧重于某单一成分的功能剖析及它们之间的相互作用网络；其次，无论是MSC-Exos还是修饰后的外泌体，都只作用于小型动物体内且具体的机制仍未阐明，因此它们在体内的安全性和有效性仍需要进一步观察与研究，将来可在大型动物体内进一步验证。总之，挑战依然存在，但外泌体对于OA的诊疗作用已显示出巨大潜力，对其进行深入研究必将产生重大影响。