微卫星不稳定及免疫治疗在分化型甲状腺癌中的研究进展

邱燕如 戴毅君 戴炀斌 综述 许天文 审校

甲状腺癌是发病率最高的内分泌系统恶性肿瘤。2019年12月国际癌症研究机构发布的数据显示，全世界每年约55万例新发甲状腺癌，全球女性发病率为10.2/10万，男性为3.1/10万［1］。中国发布的《2015年中国恶性肿瘤流行情况分析》报告指出，全国每年新发甲状腺癌20.1万例，居全国恶性肿瘤发病率第7位，女性恶性肿瘤发病率第4位［2］。在过去30年中，甲状腺癌的发病率增加了3倍，尤其以甲状腺乳头状癌的增长速度最快，但死亡率趋于稳定，一部分原因是因为检出率的增加和过度诊断［3-4］。根据病理类型的不同，甲状腺癌分为分化型甲状腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）、未分化型甲状腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）和甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）。DTC又分为乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）和滤泡状甲状腺癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）［5］。DTC约占甲状腺癌总数90%，PTC和FTC分别约占甲状腺癌80%～85%和10%～15%，5年生存率分别为90%～95%和80%［6-9］。早期DTC经过手术治疗、131I放射治疗以及促甲状腺激素抑制内分泌治疗能够获得良好的预后，但是仍有约20%的患者会在术后复发转移，且此部分患者分化程度差，使用传统的治疗方法疗效有限［10-11］，甚至1%的复发型DTC会转化为ATC，预后极差。尤其是就诊时已经存在远处转移的DTC患者，其5年生存率不足35%［12］。有研究［13］显示，晚期患者进行手术并不能降低其复发率。因此，寻找新的治疗手段，对改善此部分患者的预后具有重要临床意义。

1 微卫星不稳定

微卫星（microsatellite，MS）又称为简单重复序列，一般由1～6个核苷酸组成重复序列，重复15～60次，广泛存在于原核生物与真核生物系统中［14］。微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指重复的DNA片段自发丢失或增加。错配修复系统（mismatch repair，MMR）是体内DNA修复重要机制之一。在细胞分裂过程中，MS的重复受MMR的监视，当DNA复制过程中出现基因插入、缺失和碱基错配时，MMR系统可以识别并纠正错误复制。MMR系统缺陷可以使细胞在细胞分裂过程中无法调节其MS的长度，导致DNA片段丢失或增加并不断累积，形成MSI［15］。MS分为3类：高频微卫星不稳定（microsatellite instability high，MSI-H），低频微卫星不稳定（microsatellite instability low，MSI-L），微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）［16］。

2 MSI的检测方法

目前，主要通过MSI-聚合酶链反应（MSI-PCR）和MMR-免疫组织化学（MMR-IHC）评估MS状态。MSIPCR有2种测序方法：1）1997年召开的国际共识会议上提出由5个标记基因组成并统一分析MSI，包括2个单核苷酸（BAT-25、BAT-26）和3个二核苷酸（D5S346、D2S123、D17S250）重复序列，通过聚合酶链式反应法（PCR）检测这5个基因是否存在突变而确定MS的类型。5个基因中有2个及以上不稳定序列的肿瘤定义为MSIH，1个不稳定序列的肿瘤定义为MSI-L，无不稳定序列的肿瘤定义为MSS［17］，也是目前检测MSI的“金标准”；2）2004年美国国家癌症研究所提出的通过检测5个单核苷酸重复序列（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27）判断MS类型，该方法的敏感度和准确性高于前者［18］。MSI是由于MMR系统缺陷导致的，因此可以通过免疫组织化学法检测MMR系统4个重要基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2编码的4种同源蛋白。种系和（或）体细胞突变或表观遗传沉默可引发基因失活使蛋白表达缺失，4个基因中任一基因失活导致蛋白表达缺失定义为错配修复功能缺陷（defective DNA mismatch repair，dMMR），4个基因完整表达蛋白则定义为错配修复功能正常（proficient DNA mismatch repair，pMMR）［19-20］。MSIPCR和MMR-IHC此2种检测方法的符合率为93.4%［21］。2018年欧洲肿瘤内科学会（ESMO）指南专家共识推荐检测的第1种方法是MMR-IHC，因为此方法检测成本低、简便。若IHC结果不确定，或者仅有1个异二聚体亚基缺失，则建议MSI-PCR分子检测［22］。

3 MSI的临床应用

不同类型的恶性肿瘤中MSI-H 的发生率不同，不同研究显示的数据不尽相同。Chang 等［23］研究发现MSI-H发生率较高的实体瘤为甲状腺癌（63%）、子宫内膜癌（26%～33%）、结直肠癌（15%～20%）、胃癌（8%～22%）等。Bonneville 等［24］发现MSI-H 在各实体瘤中的发生率较高的为子宫内膜癌（26%～33%），结肠癌（19.7%）比直肠腺癌（5.7%）发生率更高。多项研究证实，MSI 的发生率与大肠癌、胃癌等的预后及治疗反应密切相关。Ziadi 等［25］的研究发现MSI表型患者相对于MSS 患者具有更好的预后。KEYNOTE-016、KEYNOTE-164 等研究证实MSI-H 的转移性结直肠患者的免疫治疗效果明显优于MSS 患者［26-27］。且有研究［28］显示，错配修复缺陷型癌症中大量的突变新抗原使其对免疫检查点抑制敏感，而与癌症的起源组织无关，即免疫检查点抑制剂能使任何系统的MSI-H实体瘤患者获益。由于MSI-H癌症患者对免疫检查点抑制剂（如nivolumab 和pembrolizumab）的治疗反应显著，因此检测肿瘤MSI状态变得更具有临床意义。因此，测定复发转移性甲状腺癌中MSI 的发生率可能有助于对预后的判断以及对免疫检查点抑制剂治疗反应的预估。

4 MSI在DTC中的发生率及其与临床预后的关系

4.1 MSI在DTC中的发生率

MSI 在DTC 中的发生率为10%～70%（表1）。Genutis等［29］采用PCR法检测485例患者MSI类型，发现MSI-H 在FTC 中的发生率仅为2.6%（4/156），而在其他类型中不表达，应用IHC 检测MSI-H 患者MMR突变，其中3例MSH2/MSH6缺失，1例MLH1/PMS2的表达不明确。Santos等［30］研究显示，MSI-H在PTC和FTC 中的发生率分别为54.3%和75.0%，虽然该研究未检测MMR 的4 个基因突变情况，但进行MLH1 蛋白表达的检测结果显示MSI 表型与患者MLH1 的下调相关，与Mitmaker 等［31］研究结果相似。不同试验之间甲状腺癌MSI发生率的表达差异较大，原因可能是纳入的研究病例数较少，以及检测方法不同导致试验结果的差异。另外，一些表达率较高的研究相对比较早期，可能是因为早期的研究中，采用聚丙烯酰胺凝胶测定MS长度时经常出现假阳性，这可能会混淆MSI状态的准确测定［29］。

4.2 MSI对甲状腺癌生物学行为、临床病理特征及临床预后的影响

一项荟萃分析汇总13项12 782例以MSI为特征的结直肠癌患者临床预后，结果显示MSI患者有更长的总生存期（overall survival，OS）和无病生存期（disease-free survival，DFS）［37］。但MSI 甲状腺癌患者与临床预后的关系尚无定论。Santos 等［30］对96 例甲状腺肿瘤患者（包括82 例恶性肿瘤和14 例良性肿瘤）的研究发现，恶性病变表现出较高的MSI 模式，无论是PTC 还是FTC 均有较高的MSI-H 发生率，但是在良性病变的甲状腺组织中未发现MSI-H，且MSI不是甲状腺肿瘤发生的早期事件，该机制参与了肿瘤的进展，与肿瘤的恶性度和病理因素有关并且预示着不良的预后。

对于临床特征，Onda 等［38］研究显示MSI-H 的发生率与患者的年龄、淋巴结转移相关，年龄＞70 岁以及淋巴结转移数＞2 枚的患者MSI-H 发生率显著升高。Mitmaker 等［31］研究发现虽然MSI 状态与肿瘤大小无显著性差异，但肿瘤大小＞4 cm组的MSI-H肿瘤较微卫星稳定（MSS/MSI-L）肿瘤的发生率更高。Dobosz等［32］研究却显示，MSI主要发生于肿瘤的早期阶段，但因为该研究的病例数较少，差异无统计学意义。Vaish 等［39-40］对甲状腺恶性肿瘤中MSI 5 个基因位点进行了检测，发现在甲状腺癌中主要是BAT-26、BAT-40 2个基因发生了突变，分别为33%和19%，并且评估了BAT-26/BAT-40突变甲状腺肿瘤与癌症发生风险的相关性；若无远处转移，年龄＜40 岁的男性和年龄＜50 岁的女性风险较低，有轻微包膜侵犯、原发肿瘤＜5 cm 且无远处转移的甲状腺内肿瘤的老年患者具有较低的潜在风险，且MSI-H 患者的临床预后优于MSI-L患者。

目前，碘难治性甲状腺癌、多次复发甲状腺癌、未分化甲状腺癌一直是甲状腺癌治疗的难点，临床亟需寻找更加有效的治疗方式，其中免疫治疗成为了关注的热点。免疫检查点抑制剂有众多的生物预测指标，MMR/MSI是重要的成员之一，关于MSI在DTC中发生率的相关研究，大部分显示MSI-H在DTC中有较高的发生率，使得免疫治疗作为DTC的治疗手段成为可能。已有研究证明［41-42］免疫治疗能使晚期甲状腺癌患者得到生存获益，但仍需要可靠的生物标志物来区分敏感患者和预测治疗反应。大量证据支持dMMR/MSI-H可作为指导免疫检查点抑制剂临床应用的预测性生物标志物，免疫检查点抑制剂能使任何系统的dMMR/MSI-H实体瘤患者获益，而不考虑组织来源［27，43］。因此，检测甲状腺癌患者dMMR/MSI-H的发生率，对指导此部分患者的免疫治疗具有重要临床意义。

5 MSI促进DTC免疫治疗疗效的机制

免疫系统在识别和清除肿瘤细胞中发挥重要作用，癌细胞试图通过抑制肿瘤特异性免疫T细胞和NK细胞，诱导抑制性T细胞表达等多种机制逃避免疫系统的识别和破坏［44］。免疫治疗的目标是免疫系统，其可以独立于细胞起源、肿瘤分期或驱动突变而有效。研究显示［45］，由于肿瘤突变负荷增加以及肿瘤新抗原持续更新，MSI肿瘤对免疫检查点抑制剂反应良好，MSI肿瘤具有更高密度的Th1、效应记忆T细胞、原位增殖T细胞和抑制性PD1-PDL1细胞以及增加的移码突变，移码突变是免疫系统识别的免疫原性新抗原的潜在来源。MSI是由于MMR相关基因的表观遗传学沉默或由DNA修复基因的种系突变引起的MMR系统缺陷，无论细胞来源如何，错配修复缺陷型肿瘤的基因组均含有数百至数千个体细胞突变，而基因突变数量与免疫检查点抑制剂的疗效显著相关［45］。基础研究显示多种实体瘤（无论组织来源）的MSI-H患者能够从免疫检查点抑制剂中获益，且有研究［29-30］显示MSI-H在DTC中有较高的发生率，因此，免疫治疗可能对此部分患者有效，为不可手术或术后复发以及131I治疗无效的患者提供了新的思路。相关报道也证明此观点，一项个案报道［46］中指出，免疫治疗能使进展期甲状腺癌获益，1例MSI-H和MSH2体细胞移码突变的FTC患者接受了帕博丽珠单抗治疗，可持续反应。Ⅱ期临床研究KEYNOTE-158探索了帕博丽珠单抗对MSI-H/dMMR晚期实体瘤的有效性和安全性，最新报道［47］显示，截至2018年5月，来自18个国家55个地点的233例MSI-H/dMMR非结肠癌患者被纳入研究（包括5例甲状腺癌），疗效分析显示客观缓解率（objective response rate，ORR）为34.3%，其中23例（9.9%）患者完全缓解（complete remission，CR），57例（24.5%）部分缓解（partial response，PR）。安全性分析显示，151例（64.8%）出现治疗相关不良事件，其中34例（14.6%）出现3～5级治疗相关不良事件，最常见的治疗相关不良事件是疲劳、瘙痒、腹泻和乏力，该临床研究尚在进行中。上述研究均表明免疫治疗可能对甲状腺癌有效。

6 免疫治疗在甲状腺癌中的临床试验结果

虽然目前免疫治疗在甲状腺癌中开展的临床实验较少，但上述结果亦证明了免疫治疗可能是晚期甲状腺癌患者有效的治疗手段，此观点也得到基础实验和临床研究的证实。基础实验显示，检查点抑制剂的效果已在小鼠总胆固醇（TC）的同基因免疫能力模型中得到了验证。Brauner等［48］建立动物模型对比了单独免疫检查点抑制剂以及免疫检查点抑制剂联合BRAF 抑制剂（BRAFi）对侵袭性甲状腺癌肿瘤消退和肿瘤内免疫应答的影响，结果发现联合治疗组小鼠肿瘤体积显著降低，抗PD-L1 处理可增强BRAFi对肿瘤消退的作用，并在ATC免疫功能正常的模型中增强抗肿瘤免疫应答。Bastman等［49］发现PD-1表达可能是甲状腺肿瘤浸润CD8+和CD4+T细胞的特征，这表明检查点抑制剂治疗可能是增强甲状腺癌细胞毒性T细胞反应从而控制肿瘤的有效方法。

临床研究亦获得了数据，一项个案报道［50-51］显示纳武利尤单抗可以使得BRAFV600E基因突变的甲状腺癌获益：1例BRAFV600E基因突变且PD-L1表达阳性的由Ⅰ期PTC 术后复发转变为晚期ATC 的患者，给予维罗非尼（vemurafenib）联合纳武利尤单抗治疗，治疗20 个月后患者疗效评价CR。Ⅰ/Ⅱ期临床研究［41］NCT02404441纳入40例ATC患者，分析spartalizumab对晚期/转移性ATC的疗效及安全性，结果显示，ORR为19%，3 例CR，5 例PR。对所有患者进行PD-L1 检测，发现28例（70%）表达阳性，PD-L1表达阳性患者效果优于阴性患者（28.6%vs.0），尤其是PD-L1 肿瘤比例评分（tumor proportion score，TPS）≥50%患者效果尤为显著。安全性分析显示，19例患者（47.5%）出现了与治疗相关的不良事件，最常见的是腹泻、瘙痒、疲劳和发热，大部分为1/2级不良反应，其中4例患者（10%）为3/4 级不良事件。Ⅰb 期研究KEYNOTE-028纳入22例DTC患者，探索了帕博丽珠单抗对进展期DTC 患者的疗效和安全性，该研究仅纳入了PDL1 TPS≥1%的DTC，结果显示中位随访时间为31 个月，中位无进展生存期（median progression-free survival，mPFS）为7 个月（95%CI：2～14 个月）；中位总生存期（median OS，mOS）未达到，2 例（9%）PR，12 例（55%）疾病稳定，不良反应的发生率为83%，主要是腹泻和疲乏，无发生与治疗有关的停药或死亡［50］。目前，尚有数个检查点抑制剂单独或联合其他治疗手段用于经过标准治疗失败的甲状腺癌的临床试验正在进行（表2），期待进一步的临床数据支持免疫治疗在甲状腺癌中的应用。

7 结语

对于DTC 中MSI-H 的发生率报道不一，其原因可能与样本量较少、地区间的差异以及研究实验方法不同有关，尤其是MMR-IHC 方法检测MSI 状态依赖于病理科医生对免疫组织化学结果的判读，受主观意识的影响较强。且对于DTC 中MSI 的研究相对较早，近几年的参考文献有限，需要更多的研究进一步探索证实。MSI在结直肠癌中的研究最多，但其对患者预后的影响尚无定论，在DTC中的研究较少，结论有争议，因此MSI是否是肿瘤进展的标志有待更多基础研究探索发现。研究显示［29］，MSI-H 实体瘤能够从免疫治疗中获益，也有临床研究显示免疫治疗能够使DTC 患者生存获益，但目前相关临床研究较少，尚无确切的证据表明免疫检查点抑制剂对进展期DTC的疗效和安全性，有待更多前瞻性、多中心的临床研究进一步证实。