钡盐法从二氯苯磺酸-亮氨酸复合物制备亮氨酸的研究

2020-01-10姚小平王艳领

贵州大学学报(自然科学版) 2020年1期

刘勋，姚小平，王艳领，彭荣

(重庆工贸职业技术学院生物化学工程系，重庆 408000)

氨基酸可作为营养物质、药物及化工原料。蛋白质水解提取法是生产氨基酸的一种重要方法[1-7]。以动物毛发(人发、猪毛、鸭毛、鸡毛等)为原料的氨基酸生产工艺已在工业上广泛应用，提取的品种已从单一的胱氨酸到同时提取胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸等多种氨基酸[8-14]。从毛发中提取氨基酸的传统工艺流程如下：

其中胱氨酸和酪氨酸是采用中和沉淀法分离，精氨酸一般采用离子交换树脂法分离[11]，亮氨酸一般采用二甲苯磺酸沉淀法分离[12-14]。

作者提出了一条新的生产工艺[15]，基本工艺流程如下：

二氯苯磺酸与二甲苯磺酸结构相似，前者苯环上有两个氯原子，后者苯环上有两个甲基。它们都是高效的氨基酸沉淀剂。二甲苯磺酸只能沉淀亮氨酸，二氯苯磺酸既能沉淀亮氨酸，也能沉淀精氨酸。在新工艺中使用二氯苯磺酸为沉淀剂，从毛发水解液中选择性地分步沉淀亮氨酸和精氨酸。沉淀亮氨酸、精氨酸后的母液可继续分离提取胱氨酸和酪氨酸。新工艺简化了工艺流程，大幅度提高了亮氨酸、精氨酸的收得率，方便了母液的综合利用，减轻了环境污染。

二氯苯磺酸从水解液中沉淀亮氨酸得到二氯苯磺酸-亮氨酸复合物。但由于水解液中成分复杂，且沉淀有很强的夹带与吸附效应，导致从水解液中得到二氯苯磺酸-亮氨酸复合物沉淀纯度较低，需进一步提纯。本文研究了二氯苯磺酸-亮氨酸复合物提纯的方法。

为制备亮氨酸产品，还需将二氯苯磺酸除去或分离。可以借鉴的是二甲苯磺酸-亮氨酸复合物的分离方法[13,14]，采用的方法是在氨性溶液中加热，再冷却，亮氨酸形成结晶析出，二甲苯磺酸阴离子与铵离子溶解在溶液中。但这一方法在二氯苯磺酸-亮氨酸复合物的分离中并不适合。因为二氯苯磺酸铵在水中的溶解度较小，在同样的条件下，二氯苯磺酸铵与亮氨酸同时析出结晶，无法实现二者的分离。

作者提出了一种利用钡盐与二氯苯磺酸形成难溶沉淀的新方法，实现了二氯苯磺酸与亮氨酸分离，最终得到符合质量要求的亮氨酸产品。

1 实验材料与方法

1.1 原材料、试剂和仪器

毛发：实验中采用鸭毛为原料，罗江晨明生化制品有限公司提供。工业盐酸：含31% HCl，工业级，用于水解鸭毛。其它化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-85C旋转蒸发器：上海青浦沪西仪器厂；DK-98-IIA电热恒温水浴锅：天津泰斯特仪器有限公司；85-2磁力搅拌器：江苏金坛大地自动化仪器厂；SHA-B恒温水浴振荡器：金坛实验仪器公司；UV-1801紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；液相色谱仪：LabTECH，北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1二氯苯磺酸沉淀亮氨酸

按文献[15]的方法从鸭毛水解液中沉淀亮氨酸，得到二氯苯磺酸-亮氨酸复合物沉淀。

1.3.2二氯苯磺酸-亮氨酸复合物沉淀重结晶

按1.3.1的方法，由400 g鸭毛的水解液沉淀得到二氯苯磺酸-亮氨酸复合物沉淀粗品，置于烧杯中，加适量水，加热至80℃，得重结晶溶解液，溶液体积约500 mL。静置，冷却至室温(20℃)结晶，12 h后抽滤，用水洗涤两次，干燥得二氯苯磺酸-亮氨酸复合物沉淀精品。

1.3.3钡盐法脱除沉淀剂

将二氯苯磺酸-亮氨酸复合物沉淀精品50 g置于烧杯中，加水，加热至80℃溶解，溶解液约200 mL。趁热加入75 mL 250 g/L氯化钡溶液，维持温度60℃，搅拌1 h。再搅拌冷却至室温。抽滤，用水洗涤两次，得滤液320 mL。

1.3.4制取亮氨酸

脱除沉淀剂后滤液旋蒸至约100 mL，冷却结晶，抽滤，得亮氨酸粗品。再采用常规的水溶、脱色、浓缩、结晶的方法精制，得亮氨酸精品。

1.3.5二氯苯磺酸沉淀剂再生

将脱除沉淀剂得到的二氯苯磺酸钡沉淀(干重41 g)置于200 mL烧杯中，加50 mL水搅散，呈泥浆,加热至80℃，一次性加入3 mol/L硫酸25 mL，继续保温搅拌反应2 h。抽滤，水洗三次。滤液为回收的二氯苯磺酸沉淀剂，滤渣为硫酸钡。

1.3.6液相色谱法测定氨基酸含量

采用大连依利特公司的氨基酸分析系统，按文献[16]的方法进行氨基酸分析。

1.3.7二氯苯磺酸盐溶解度的测定

取适量二氯苯磺酸-亮氨酸复合物、二氯苯磺酸铵、二氯苯磺酸钠和二氯苯磺酸钡于100 mL锥形瓶中，加水20 mL，样品量应足够，以保证样品不会完全溶解。在恒温水浴震荡器中震荡10 h，静置2 h。取清液稀释，在274 nm处用紫外可见分光光度计测定其吸光度，与标准样对照计算样品中二氯苯磺酸的含量，再推算此二氯苯磺酸盐在水中的溶解度。

2 结果与讨论

2.1 工艺路线

采用二氯苯磺酸沉淀法，以毛发为原料提取氨基酸是先将毛发酸水解，再从水解液中沉淀亮氨酸，得到二氯苯磺酸-亮氨酸复合物。再对复合物重结晶、脱除沉淀剂及精制工序最终得到亮氨酸产品。为提高亮氨酸产品收率，还需对工艺过程中产生的母液合理套用，最终形成的亮氨酸提取工艺路线见图1。

图1 亮氨酸提取工艺路线Fig.1 Process route for extracting leucine

2.2 二氯苯磺酸-亮氨酸复合物沉淀的精制

毛发水解液含有十七种氨基酸及其它杂质，从毛发水解液中沉淀得到的二氯苯磺酸-亮氨酸复合物含杂量很高(表1)，需进一步提纯。

二氯苯磺酸-亮氨酸复合物是一种依靠静电引力的盐结晶，在水中的溶解度随温度升高而升高。因此可以采用在水中升温溶解、再降温结晶的方式进行精制。实验发现，在80℃溶液中，结晶完全溶解，冷却到室温(20℃)可析出大量结晶。

按1.3.1和1.3.2的方法，从400 g羽毛水解液得到二氯苯磺酸-亮氨酸复合物粗品80.4 g；重结晶后得到二氯苯磺酸-亮氨酸复合物精品50.0 g。各种物料中氨基酸分布情况见表1。

表1 各种物料相对比例及氨基酸含量(单位：g)Tab.1 Relative proportion of various materials and amino acid content (unit: g)

由表1可见，二氯苯磺酸-亮氨酸复合物粗品中含有大量的其它氨基酸，经过重结晶精制后得到的复合物精品中其它氨基酸含量大幅降低，其它氨基酸占氨基酸总量的比例由粗品的51.0%降为5.2%；亮氨酸占氨基酸总量的比例由粗品的49.0%提高到94.8%，可见精制效果显著。

2.3 钡盐法脱除沉淀剂

与二氯苯磺酸类似，二甲苯磺酸也能与亮氨酸形成二甲苯磺酸-亮氨酸复合物结晶。为得到亮氨酸产品，常采用氨解的方法将亮氨酸与二甲苯磺酸分离，具体方法是将复合物结晶分散于水中，升温至80～90℃，加氨水调pH7～8，再冷却结晶。由于亮氨酸溶解度较小，此时亮氨酸析出，邻二甲苯磺酸及铵盐留在溶液中，可以实现亮氨酸与二甲苯磺酸的分离。

二氯苯磺酸可与阳离子在一定条件下形成结晶，阳离子包括酸性条件下带正电荷的亮氨酸，也包括铵离子、钠离子、钡离子等。表2为各种二氯苯磺酸盐在20℃条件下的溶解度和溶度积。

表2 二氯苯磺酸盐在20℃条件下的溶解度和溶度积Tab.2 Solubility and solubility product ofdichlorobenzenesulfonate at 20℃

实验发现，如果采用氨解的方法，不能实现二氯苯磺酸与亮氨酸的分离。原因是二氯苯磺酸铵的溶解度也比较小，在氨解条件下部分二氯苯磺酸铵与亮氨酸一同析出，无法有效分离。

由表2 可见，二氯苯磺酸与钡离子形成的结晶溶解度比二氯苯磺酸-亮氨酸的溶解度更小。如果在二氯苯磺酸-亮氨酸复合物的热溶解液中加入氯化钡溶液，可以生成二氯苯磺酸钡沉淀，从而释放出亮氨酸。反应式如下：

2Leu-P + BaCl2= 2Leu + BaP2+ 2HCl

式中Leu代表亮氨酸；P代表二氯苯磺酸；Leu-P代表二氯苯磺酸-亮氨酸复合物；BaP2代表二氯苯磺酸钡。

2.4 亮氨酸产品质量

按1.3.4的方法，对脱除二氯苯磺酸后的滤液蒸发浓缩，冷却结晶即可得到亮氨酸粗品。此粗品中仍含有一定的杂质，颜色为黄色。需进一步采用常规的水溶、脱色、浓缩、结晶的方法精制，得亮氨酸精品。根据氨基酸行业的质量标准和检验方法，以美国药典(USP34)标准为参照，对得到的亮氨酸产品质量进行检验，结果见表3。

表3 亮氨酸的质量标准和检测结果Tab.3 Quality standards and test results of leucine

2.5 产品收率

由图1可以看出，整个亮氨酸提取工艺过程中产生了多种含有亮氨酸的母液，可以分别套用在上一工序中，以提高产品收率。

按此方式进行五次实验，去掉首次运行的结果，计算亮氨酸的平均收率为4.1%。

2.6 二氯苯磺酸沉淀剂的回收

转化为二氯苯磺酸钡的沉淀剂需要重新转化为二氯苯磺酸，再次用于沉淀亮氨酸。本文采用加硫酸生成硫酸钡沉淀，二氯苯磺酸留在溶液中的方法。反应式如下：

BaP2+ H2SO4= BaSO4+ 2P

为了保证二氯苯磺酸完全释放，需要先将二氯苯磺酸钡沉淀在水中分散，加热，再加入稀硫酸生成硫酸钡沉淀。根据计算，41 g二氯苯磺酸钡需要3 mol/L硫酸23 mL才能完全转化为硫酸钡，为保证转化效果，可稍多加硫酸，以保证二氯苯磺酸沉淀剂回收完全。按1.3.5的方法得到硫酸钡滤渣呈黑色，含有部分有机物杂质，可能来自于水解液。硫酸钡滤渣在105℃烘干后质量为16.8 g，在850℃高温电炉中灼烧2 h后残渣质量为16.3 g。表明硫酸钡滤渣中的有机质较少，可能含有的二氯苯磺酸更少，可以认为97%以上的二氯苯磺酸沉淀剂已被回收到滤液中，可以再次用于沉淀亮氨酸。