软脉煎干预颈动脉粥样硬化的代谢组学研究※

杜文婷 顾 耘* 王臻楠 徐 辉 高 爽 王 蕾

（1 上海中医药大学附属龙华医院老年科，上海 200032；2 上海中科新生命生物科技有限公司，上海 200233）

动脉粥样硬化是众多心脑血管疾病最常见的病理基础，颈动脉粥样硬化（Carotid atherosclerosis，CAS）与冠状动脉血管受累常同时存在，可作为反映全身动脉粥样硬化的窗口［1-2］，颈动脉不稳定斑块破裂、脱落可引起脑梗死［3-4］，严重威胁着颈动脉粥样硬化患者的生命安全。

目前针对动脉粥样硬化的治疗方法都存在一定的局限性，中医学通过对动脉粥样硬化患者进行辨证论治，具有全面调节机体机能和多途径、多环节、多靶点干预的优势。课题组前期流行病学调查结果显示［5-6］，CAS 患者各常见证型均兼有肾虚证候，认为与增龄相关的血管老化是引起动脉粥样硬化的重要原因，其病因病机以肾中精气亏虚为本，痰瘀交阻为标，治疗上提出了补肾益精，兼以化痰祛瘀，创立了中药复方软脉煎，临床疗效显著［7-8］。颈动脉粥样硬化的发生、发展与体内代谢物密切相关，本项目采用非靶向代谢组学检测技术结合数据依赖采集方式，比较软脉煎治疗前后患者代谢物水平的变化，探讨软脉煎抗动脉粥样硬化作用的相关信号通路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 甲酸（06450，美国Fluka 公司），乙腈（1499230-935，德国Merck 公司），氟化铵（12125-01-08，美国Sigma 公司），高分辨率质谱仪（Triple TOF 5600+，美国ABSCIEX 公司），超高压液相色谱仪（1290 Infinity，德国Agilent 公司），色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1×100 mm column，美国Waters 公司）。

1.2 样本来源及采集 样本来源于2015 年1 月—2015 年10 月上海中医药大学附属龙华医院老年科就诊的颈动脉粥样硬化患者，共采集8 例观察者的血浆样本。将符合肾精亏虚型颈动脉粥样硬化纳入标准且未经药物干预前的患者归为对照组，经中药复方软脉煎治疗6 个月后归为试验组。抽血前1 周内要求所有纳入病例禁饮烈酒、浓茶、奶茶等。样本具体信息见表1。

表1 样品信息

1.3 诊断及纳入标准 颈动脉粥样硬化诊断标准参照《血管超声检查指南》［9］《超声医学》第四版［10］。肾精亏虚证诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》［11］、高等医药院校教材《中医诊断学》第五版［12］。纳入标准：同意接受本临床试验，符合CAS 超声影像学诊断标准，且狭窄率＜50% 的患者；符合中医肾精亏虚证诊断标准；年龄45 岁以上；未接受过动脉粥样硬化相关药物治疗；未患糖尿病、高脂血症、心脑血管疾病、肝肾损伤或血液系统相关疾病；3 个月内未接受过其他试验者。在未完成6 个月临床观察前，所有符合CAS 纳入标准并经知情同意后进入试验的患者，无论何时何因退出，视作脱落病例。

1.4 药品来源及用法 软脉煎方由熟地黄、生黄芪、补骨脂、生山楂、陈皮、荷叶、绞股蓝等组成，由龙华医院药剂科统一代煎成150 mL 独立塑封包装。用法为每日早晚各1 次，连续服用6 个月。治疗期间，禁止使用其它治疗颈动脉粥样硬化的西药、中药和中成药及与本病治疗相关的其他治疗。合并疾病所须继续服用的药物，应与本疾病无关，同时记录合并用药的剂量、用法、疗程。

1.5 实验方法

1.5.1 质控样本的制备 质控样本（Quality control samples，QC）用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。分别取每个样本50 μL 混合为QC 样本。所有样品标号后-80 ℃冰箱保存待测。

1.5.2 样本预处理 取100 μL 人血浆样本在4 ℃缓慢解冻后，加入400 μL 预冷甲醇/乙腈（1∶1，v/v），涡旋混合60 s，-20 ℃放置15 min，14000 g 4 ℃离心15 min，取上清400 μL，真空干燥，质谱分析时加入100 μL 乙腈水溶液（乙腈∶水=1∶1，v/v）复溶，涡旋，14000 g 4 ℃离心15 min，取上清液进样分析。

1.5.3 色谱-质谱分析 采用Agilent 1290 Infinity LC 反相超高效液相色谱系统（UHPLC）进行分离。柱温25 ℃；流速300 μL/min；进样量2 μL。HSS T3 色谱柱正离子模式流动相组成A：0.1% 甲酸水溶液，B：0.1% 甲酸乙腈；负离子模式流动A：0.5mM 氟化铵水溶液，B：乙腈。

分别采用电喷雾电离正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC 分离后用Triple TOF 6600 质谱仪进行质谱分析。二级质谱采用数据相关采集系统获得，采用高灵敏度模式，去簇电压：±60 V（正负两种模式），碰撞能量：35±15 eV。

1.6 统计学方法 原始数据经ProteoWizard 转换成.mzML格式，采用XCMS 程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（＜25 ppm）和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库。对XCMS 提取得到的数据，删除2 组内缺失值均＞50%的离子峰。采用Peratoscaling 方法进行归一化处理后，应用MetaboAnalyst 软件进行多维统计分析，包括主成分分析（Principal component analysis，PCA）和最小二乘法判别分析（Partial least square-discriminant analysis，PLSDA）。单维统计分析包括t 检验和变异倍数分析，R 语言软件进行火山图分析。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入男性3 例，女性5 例；平均年龄64.63 岁，体质量指数（22.36±1.74）kg/m2，患者均无合并其他基础疾病，未经动脉粥样硬化相关的他汀类药物治疗。所有病例血尿粪常规、肝肾功能、血糖、心电图治疗前后比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

2.2 治疗前后颈动脉粥样硬化患者颈动脉超声、中医证候积分 与对照组比较，试验组颈动脉内中膜厚度、中医证候总积分降低（P＜0.05），颈动脉斑块面积和斑块分级情况未见明显改变（P＞0.05）。见表2～3。

表2 治疗前后颈动脉粥样硬化患者颈动脉IMT、斑块面积情况比较 （）

表2 治疗前后颈动脉粥样硬化患者颈动脉IMT、斑块面积情况比较 （）

注：与对照组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

表3 治疗前后颈动脉粥样硬化患者斑块分级情况比较[例(%)]

2.3 治疗前后颈动脉粥样硬化患者血脂 与对照组比较，治疗后TC、LDL-C 降低（P ＜0.05）；TG、HDL-C、VLDL-C、等未见明显改变（P ＞0.05）。见表4。

表4 治疗前后颈动脉粥样硬化患者血脂比较（，mmol/L）

表4 治疗前后颈动脉粥样硬化患者血脂比较（，mmol/L）

注：与对照组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

2.4 主成分分析、偏最小二乘判别分析 采用主成分分析对各样本组进行组间比较，PCA 得分如图1～2。正、负离子模式数据，在PC1 和PC2 维图上试验组-对照组组间有明显的分离趋势。建立PLS-DA 模型，PLS-DA 得分图如图3～4，结果表明偏最小二乘判别分析模型能区分该比较组。所有PLS-DA 模型经Leave one out 循环交互验证得到的模型评价参数（R2，Q2）列于表5，R2 和Q2 越接近1 表明模型越稳定可靠。

表5 PLS-DA 模型的评价参数 （cum）

2.5 初步筛选组间差异物 建立PLS-DA 模型，以变量投影重要度（Variable Importance for the Projection，VIP）＞1 为筛选标准，初步筛选出各组间的差异物，见图5～6。对试验组-对照组进行单变量统计分析，如下火山图所示，蓝色点为变异倍数（Fold change，FC）＞2.0 且P ＜0.05 的代谢物，即单变量统计分析筛选的差异代谢物。

2.6 筛选显著性差异化合物 选择同时符合多维统计分析筛选标准和单变量统计分析筛选标准的代谢物作为具有显著性差异的代谢物，试验组与对照组比较，正离子模式下，具有差异的代谢物为：甘氨胆酸和不饱和油酸。见表6。负离子模式下，具有显著性差异的代谢物为：次黄嘌呤、胆酸、腺苷酸、腺嘌呤、乙酰-DL-亮氨酸。见表7。

表6 正离子模式软脉煎治疗前后差异代谢物

表7 负离子模式软脉煎治疗前后差异代谢物

2.7 层次聚类 利用定性的显著性差异代谢物的表达量对各组样本进行层次聚类，结果显示，负离子模式下，试验组-对照组之间的差异代谢物可以将同组样本聚集在同一簇中；说明筛选的候选代谢物合理且较为准确。详见图9。

图1 正离子模式PCA 得分图

图2 负离子模式PCA 得分图

图3 正离子模式PLS-DA 图

图4 负离子模式PLS-DA 图

图5 正离子模式初筛代谢物

图6 负离子模式初筛代谢物

图7 正离子模式火山图

图8 负离子模式火山图

图9 ZXT-BT 组负离子模式显著性差异代谢物的层次聚类

2.8 KEGG 代谢通路分析 将试验组与对照组比较分析得到的全部差异代谢物提交到KEGG 网站，进行相关通路分析。肾精亏虚型颈动脉粥样硬化患者经软脉煎治疗后与治疗前的所有差异代谢物共参与64 条通路，其中2 种及以上差异代谢物同时参与的代谢通路共8 条，列举如下表8。

表8 软脉煎治疗前后显著性差异代谢物通路分析

3 讨论

代谢组学研究的主要目标是获得和定量生物相关样品的小分子代谢物，如细胞、组织、体液、器官或整个有机体。其分析策略是将所研究样本中的全部代谢成分进行描述，然后将它们的浓度与样本的特性或属性相联系，寻找试验组与对照组之间的差异性代谢物［13］。目前主要运用于医学生命科学、植物/食物和环境科学中寻找标记物。在医学领域中，代谢组学用于探索疾病的早期标记物（诊断标记物），作为药物疗效的评判（药物代谢组学）、疾病进展及预后（预后标记物）或者药物毒性（安全评估）［14-15］的指标。

近年来，代谢组学也被较多地应用于心血管疾病方面的研究。采用核磁共振代谢组学法动态观察金黄地鼠动脉粥样硬化过程中的代谢轮廓改变［16］，结果显示，在动脉粥样硬化进展中，脂质代谢、糖代谢、氨基酸代谢等均发生紊乱，并伴随炎症和氧化应激的出现。研究表明［17］，血浆代谢产物能够反映氧化应激病理过程，因此可以作为生物标志物用于动脉粥样硬化相关疾病进程研究。目前，代谢组学在中医治疗心血管疾病的研究领域中已经取得了一些进展，如程鹏等［18］运用气相色谱质谱联用的代谢组学研究方法测定冠心病痰浊证与气虚证患者血清内源性代谢物，结果显示，痰浊证与气虚证患者可被有效区分开。

本研究提示，经过具有补肾益气功效的中药复方软脉煎干预后，肾精亏虚型颈动脉粥样硬化患者次黄嘌呤、胆酸、腺苷酸、腺嘌呤、乙酰-DL-亮氨酸等代谢物谱发生改变，引起相关的上述代谢通路随之发生改变，从而发挥改善患者临床症状、限制颈动脉粥样硬化进展等功效。其中，初级胆汁酸生物合成、次级胆汁酸生物合成、胆汁分泌、嘌呤代谢等代谢通路中，同时出现的差异代谢物种类最多，我们认为，这4 条代谢通路可能是软脉煎作用的主要代谢途径，值得作为软脉煎抗肾精亏虚型颈动脉粥样硬化机制研究的靶点进行深入探索。

由代谢组学得出的研究结果可能有助于理解疾病的发生、发展，进而及时给予治疗干预［19］。但非靶向代谢组学分析的结果可能存在误差，所以，当发现生物标记物后，为确保所得结果并非偶然，建议采用LC-MS 再次检测不同的标本，以保障结果的可靠性。通过验证研究确定生物标记物的可靠性后，采用已有的方法对其进行定量化，再次验证生物标记物的浓度在试验组和对照组是的确存在显著性差异的。目前限制全球运用代谢产物分析的原因主要在于缺乏为大家所公认的分析方法的标准方案，并且代谢组学的关键分析技术——LC-MS 的稳健性和再现性也存在一定的局限。此外，代谢组学虽已在临床前和临床研究中得到应用，但是目前包括本项课题在内的这些研究中绝大多数都是小样本量研究。在未来的研究中，期待能开展更大型的流行病学研究，以来自不同地区的大样本受试者的样品为研究对象进行分析，从而为动脉粥样硬化防治机制的探索提供客观依据。