A亚型患者血型鉴定流程及输血策略研究

杨璇 郭思维 洪强

ABO血型是最早发现的、免疫原性最强的血型系统，正确的血型鉴定是确保输血安全的首要条件[1-3]。A亚型在ABO血型中最常见,A1型占大多数, 少数为Aint、A2。此外，还有A3、Ax、Am、Aend、Ael等[4]。本文运用血清学和分子生物学方法对1名A2亚型患者进行血型鉴定，分析其血清学特征，进行家系调查，并进一步延伸，探究其它A亚型的鉴定方法和安全输血策略。

1 材料与方法

1.1 研究对象

患者李某，男，63岁，因右侧面部肿物半年住院治疗。术前备血行血型鉴定时发现其正定A型反定O型，正反定型不一致。其家系成员共5人，包括患者及其配偶、儿子、女儿以及外孙女。血液检测经患者及家属知情同意。

1.2 试剂与仪器

ABO血型检测卡： 长春博迅，抗-A、抗-B 、抗-A1、抗-H试剂、ABO反定细胞：上海血液生物医药有限责任公司，抗AB：法国Diagast公司，人源抗-A由本实验室制备（多人份抗筛阴性效价≥128的B型血浆）。抗人球蛋白卡：西班牙戴安娜公司，凝聚胺试剂盒：珠海贝索生物技术有限公司。由天津秀鹏生物技术有限公司完成ABO基因PCR-SSP分型和测序。

1.3 方法

1.3.1 血型血清学试验 抽取全部成员EDTA-K2抗凝的静脉全血2 mL，鉴定患者血型采用凝胶微柱法与试管法，血清不规则抗体筛查采用盐水法、凝聚胺法与卡式抗人球蛋白法，检测唾液中ABH血型物质。必要时，使用人源抗-A进行红细胞吸收放散试验，以验证红细胞表面是否存在弱A抗原。家族其他成员ABO血型鉴定采用试管法。以上均严格按照《全国临床检验操作规程》[5]的要求进行。

1.3.2 ABO基因分型 由天津秀鹏公司完成基因组DNA提取，将PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶以140-150V条件下电泳15～20分钟，凝胶紫外成像。

1.3.3 ABO基因测序 由天津秀鹏公司完成患者ABO基因第1-7外显子的基因测序，根据NCBI网站提供的Names for ABO （ISBT 001） blood group alleles v1.1 171023综合结果判定。

1.3.4 交叉配血试验 使用患者血浆进行盲筛，选择与患者不产生凝集反应的A型红细胞。或者选择O型洗涤红细胞进行交叉配血试验。

2 结果

2.1 血型血清学结果

结果显示，患者正定型为A型，其红细胞与抗-A、抗-AB 均发生凝集，与抗-A1弱凝集。其反定型为O型，患者血浆与A1红细胞弱凝集、B 细胞发生凝集，考虑其血型为A亚型。患者配偶、儿子ABO 血型及抗-H 结果显示正常，其女儿正反定型为AB型，但与抗-A1不凝集，为A2B 型，见表1。

表1 患者及其家系ABO 血清学试验结果

2.2 不规则抗体筛查

抗筛阴性，未检出不规则抗体。

2.3 ABO基因分型结果

结果显示：1,2,4,6,7,8,9,11孔阳性，对照ABO基因PCR-SSP分型结果表，该患者为A205O1，见图1。

图1 患者ABO基因PCR-SSP结果

2.4 ABO 1-7 外显子测序结果

测序结果： A205/O01

2.4.1 EXON1～5测序结果 没有发生突变。

2.4.2 EXON6测序结果 第261号碱基鸟嘌呤（G）缺失,导致第88位氨基酸发生移码突变（Thr/Pro）。见图2。

2.4.3 EXON7测序结果 第467号发生单个碱基替换，胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）,导致第156位氨基酸改变（Pro/Leu）见图3。第1009号发生错义突变，碱基鸟嘌呤（A）突变为腺嘌呤（G），导致第337位氨基酸改变（Arg/Gly）。见图4。

2.5 输血方案

选择A2型红细胞、血小板及血浆进行输注。笔者认为亦可使用O型洗涤悬浮红细胞、A 型血浆和血小板进行输注。

3 讨论

ABO血型位于第9号染色体上，包含7个外显子，有3个主要等位基因， A基因和B基因通过编码产生糖基转移酶，进而控制ABO血型抗原的合成[6-7]。当前人类血型抗原基因突变库已发现A2等位基因有20个，本研究该病例为第467位的单个碱基替换（C＞T）和第1009位的错义突变（A＞G），是典型A2O5[8]。

由于ABO 血型抗原表达的复杂性，血清学结果存在个体差异，不同的基因型之间差异微小，相同的基因型亦略有不同。同时，也容易受主客观因素的影响。例如本研究该病例基因型在中国汉族人群中较为常见[9]，该类患者的红细胞通常不与抗-A1产生凝集反应，但是该病例却与抗-A1存在弱凝集反应，因此无法精准分型，需借助分子生物学的方法。分子生物学的应用解决了血清学的局限性，为准确鉴定血型和快速寻找合适的血液创造条件，提高输血的安全性[10]。

图2 患者ABO基因第6外显子261号碱基缺失

图3 患者ABO基因第7外显子467号碱基突变详情

图4 患者ABO基因第7外显子1009号碱基突变详情

笔者认为，实际工作中出现正定型结果和反定型结果不一致的情况时，首先应排除人为因素、技术问题，排除年龄、疾病及治疗的影响[11]，参考ABO 疑难血型三步分析法及AABB 指南[12]，归纳总结后进一步建立试验。正常A型及AB型红细胞与抗-A1的凝集强度可达到4+， A2、A3、Am、Ax、B（A）等亚型的红细胞与抗-A1几乎不反应，但Ax、Bx型红细胞与抗-AB反应强度与抗-A、抗-B相比有明显增强[13]。类孟买血型也存在红细胞A或B抗原缺失或弱表达，其血清学表现与Am、Ax、Ael、Bm、Bx 等ABO亚型十分相似，可应用抗-H加以区分[14]。唾液A、B、H 物质检测和红细胞的吸收放散试验可帮助证实是否存在弱A抗原或弱B抗原[15]。

对于ABO亚型患者,同型供血者无疑是最好的选择，但实际工作中难以实现。本研究该病例为A2亚型，据相关报道，A2亚型约占A型人群20%[16]。就当前现状，若血清中未检出抗-A1抗体，A2亚型常常漏检，因此无法从血站直接获取同型血液。笔者认为，对于有条件的地区，可以用抗-A1试剂随机筛选A型献血者，选择与其不反应的红细胞进行输注。而条件有限的地区，为了避免溶血反应或同种抗体产生，以尽可能减少异型红细胞血型抗原为输入原则, 避免输入含有其血浆中的抗体所对应的红细胞抗原的红细胞以及含有其红细胞血型抗原对应的抗体的血浆，可选择O型洗涤红细胞和亚型对应的正常血型的血浆、冷沉淀及血小板进行交叉配血。因此，笔者认为，其他A亚型患者在难以筛选同型供血者的情况下，亦可为其提供O型洗涤红细胞、A型血浆和A型血小板进行输注。