灵芝孢子粉中三萜类化合物的研究进展

夏亚飞，阎 姝

灵芝（ganodermalucidum）是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌的总称，为我国具有较高药用价值的传统珍贵中药材，自古就有“仙草”“还魂草”的美誉，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。《神农本草经》将“六芝”列为草部上品之首，并说久服皆可“轻身不老，延年神仙”，同时也是《本草纲目》中收录的唯一进入五经的药物，对心、肝、脾、肺、肾等五脏具有补益作用[1]。灵芝在世界各地均有分布，以热带和亚热带地区为多。目前已实现人工培育，其孢子粉、子实体均可入药。

灵芝孢子粉在生物学上被称为“担孢子”，是灵芝在生长发育后期从灵芝菌褶中喷射出来的极其微小的卵形生殖细胞，即灵芝的种子，能够将灵芝的遗传物质全部保留下来[2-3]。相关研究显示，灵芝孢子粉具有增强免疫调节[4]、抗肿瘤、保护肝脏等多种作用。但由于灵芝孢子粉由高分子纤维物质组成，结构稳定、质地坚硬，影响孢内物质的消化吸收，破壁后更适合肠胃直接吸收，且较灵芝其他部位有效成分的含量高[5-6]。

灵芝孢子粉三萜（Ganodermalucidumsporetriterpenes，GLST）是灵芝的主要次级代谢产物，化学结构较为复杂。根据三萜类化合物所连接的官能团和侧链结构不同，可分为灵芝酸、灵芝醇、灵芝醛和灵芝内酯等几大类[7]，一般将含有羧基的三萜类物质称为灵芝酸。灵芝酸的生理活性主要是由具有不同功能的侧链基团决定的[8]。GLST是灵芝中的主要活性成分，现已证实其具有广泛的生物活性。本文通过查阅、整理国内外的相关文献，对GLST的结构、提取工艺和生物活性等进行综述，为其深入研究提供科学依据。

1 GLST的结构

根据分子结构不同，三萜类化合物可分为单环、双环、三环、四环、五环和链状三萜。灵芝中三萜类化合物按结构分为四环或五环三萜[9]，包括灵芝酸、赤芝酸、灵芝醇等，其中多数属于羊毛甾烷衍生物，结构多样且高度氧化。根据碳原子数可分为C24、C27、C30三大类[10]。根据官能团和侧链将其命名为灵芝酸、灵芝酸甲酯、赤灵酸、灵赤酸、灵赤酸甲酯、灵芝孢子酸、赤芝孢子内酯、灵芝醇、灵芝醛和灵芝内酯等[11]。灵芝孢子粉中的三萜类化合物包括：灵芝孢子酸A (Ganosporeic acid A)、灵芝酸A、B、C、E、γ、δ、ε、ζ 和 θ(Ganoderic acid A、B、C、E、γ、δ、ε、ζ、θ)、Ganoderiol F、Ganodermanontriol、Ganodermanondiol、Lucidumol A、Lucidumol B、Lucidenicacid SP1等。

2 GLST的提取工艺

2.1 传统有机溶剂提取方法 灵芝三萜类化合物的结构特性，决定了其难溶于水、易溶于有机溶剂的特点。一般常选用乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂在常温或高温下进行浸提或回流粗提。提取的效果取决于溶剂的选取、溶剂的用量、时间、温度等因素，通过正交试验，得到最佳提取工艺参数。李康等[12]利用响应面优化提取灵芝破壁孢子粉中总三萜，含量可达6.45%，其最佳提取工艺条件为提取溶剂95%，料液比1︰60 mg/mL，温度85 ℃，乙醇回流提取2 h，提取2次。

2.2 超声波辅助提取 超声波是指频率在2×104～1×107Hz范围内的声波，经超声波处理能产生强烈的空化效应及搅动作用，增加溶剂的渗透力，从而大大提高有效成分的提取率。康同辉等[13]以灵芝为原料，通过单因素试验和正交试验设计，确定超声波辅助乙醇浸提灵芝三萜的最佳工艺条件。试验结果表明，各因素对三萜提取影响程度大小顺序为超声温度＞乙醇浓度＞超声时间＞料液比，最佳工艺条件为乙醇浓度95%、超声时间15 min、超声温度80 ℃、料液比1︰25，此时灵芝三萜得率为2.19%。Shen等[14]以灵芝孢子粉为原料，采用超声辅助工艺从灵芝孢子粉中提取了三萜类化合物，并利用响应面方法进行了优化。结果表明其超声提取的最佳工艺参数为：超声功率为564.6 W，乙醇浓度为75%，超声时间为5.4 min，料液比为1︰50，超声波探头距离为8.2 cm，在最佳超声工艺条件下，实验值（0.97±0.04）与预测值（0.99）之间无明显差异。

2.3 微波辅助提取 近年来，微波辅助提取技术作为一种新型提取技术，以提取时间短、提取效率高、选择性好等优点而被广泛采用。该技术是利用产生的高频电磁波，穿透组织外层结构而迅速到达组织内部。由于吸收微波能使组织内部温度和压力迅速上升，导致细胞破裂，有效成分自由流出，所以能够迅速、有效地提取植物类的有效成分。卢彦芳等[15]结合索氏提取的原理，自制了微波连续抽提装置，通过与传统方法的比较，研究了微波连续抽提法的特点和萃取效率，提出了最优方案：以95%乙醇为萃取溶剂，微波功率200 W，微波时间14.5 min，总三萜提取率为73.6%。

2.4 超临界CO2萃取法 超临界流体萃取技术是一种集分离、纯化、富集于一体的高新分离技术，它以临界压力、临界温度以上的CO2作为萃取溶剂，具有提取效率高、选择性好、速度快、温度低等独特优势，是一种无毒、无污染的绿色生物分离技术。另外，CO2的超临界温度低，可以有效地防止热敏性成分如灵芝三萜类成分的氧化和反应，完整保存生质物体的活性。华正根等[16]采用不同高压的超临界CO2提取法与传统的乙醇回流提取法进行比较。研究表明，高压超临界CO2提取工艺条件为：提取压力85 mPa，提取温度50 ℃，提取时间4 h，在此条件下灵芝三萜含量为1.35%，而采用乙醇回流提取法提取的灵芝三萜含量为0.92%。与传统乙醇回流提取法相比，用高压超临界CO2提取法，灵芝三萜含量提高了46.7%。

3 GLST的药理活性

灵芝三萜因其结构和种类多样性，决定了其药理学和生物学活性的多样性，具有抗氧化、保肝护肝、增强免疫、抗肿瘤、降血脂、降血糖、防治心血管疾病、缓解哮喘、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抑制血小板聚集和防治癫痫等作用。

3.1 抗氧化 自由基和活性氧作为涉及氧化还原酶和代谢过程中的副产物，可通过氧化作用来破坏细胞，这种损伤经过长期积累会引起衰老和各种年龄相关的疾病[17]。Kan等[18]研究发现水提醇沉获得GLP80具有最佳的还原能力，DPPH自由基和氧自由基清除能力最好，效果依次优于GLP、GLP60、GLP40。研究显示灵芝醇提物（EGL）可以增加Nrf2的表达和磷酸化，导致HO-1的上调以发挥其抗氧化作用[19]。

3.2 保肝护肝 灵芝三萜具有保肝作用，能使变性、坏死的肝脏细胞得到明显的改善和恢复。黄宗锈等[20]采用经典的四氯化碳（CCl4）模型，同时给予动物低、中、高剂量的灵芝三萜，通过血清生化指标的检测，发现灵芝三萜能够明显抑制CCl4引起小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的升高，此外灵芝三萜还能使肝脏组织形态学上的肝细胞变性、坏死程度得到明显的改善和恢复，表明灵芝三萜类成分对CCl4引起的肝脏损伤有较好的保护作用。赵燕平等[21]通过尾静脉注射Con A建立免疫性肝损伤小鼠模型，灌胃给予不同剂量的破壁灵芝孢子粉，研究表明破壁灵芝孢子粉能够改善Con A诱导免疫肝损伤模型小鼠血清ALT、AST水平及肝组织炎症程度。灵芝酸属三萜类化合物，可通过改善肝功能障碍，降低肝脏自由基水平，抑制脂质过氧化反应，保护细胞膜的完整，实现对免疫性肝损伤的保护[22]。

3.3 增强免疫 赤芝（GLK）中的三萜类化合物能通过增加白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor，TNF）-α的表达来刺激免疫应答，经GLK三萜治疗后，小鼠的脾脏和胸腺等免疫器官指标明显增加，GLK三萜类化合物在体外和体内均具有抗肺癌活性、免疫调节和诱导细胞凋亡的作用[23]。李立等[24]经口给予BALB/c小鼠不同剂量的破壁灵芝孢子粉连续30 d，溶剂对照组给予蒸馏水。通过刀豆蛋白A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖实验、足趾增厚实验、抗体生成细胞实验、半数溶血值实验、碳廓清实验、腹腔巨噬鸡红细胞实验和自然杀伤细胞活性测定评价免疫功能，结果表明破壁灵芝孢子粉对小鼠免疫功能具有增强作用。

3.4 抗肿瘤 肿瘤对人类的危害极大，开发安全高效的抗肿瘤药物一直是国内外研究的热点。灵芝三萜类化合物是灵芝的重要药效成分。李康等[12]研究发现灵芝总三萜对人结肠癌HCT116细胞、人肺癌A549细胞、人乳腺癌MDAMB-231细胞的IC50值分别为1.29、1.68、3.81 mg/mL；不同浓度的灵芝总三萜（0.64、1.6、4.0、10 mg/mL）作用于结肠癌HCT116细胞36 h后能显著诱导结肠癌HCT116细胞发生凋亡。柴秀丽等[25]研究破壁灵芝孢子粉（GLS）对肝癌SMMC-7721细胞裸鼠皮下成瘤模型的作用及其机制，研究表明破壁灵芝孢子粉能够抑制裸鼠肝癌SMMC-7721细胞皮下瘤体生长，其机制可能与抑制肿瘤血管生成有关。Gao等[26]通过研究灵芝三萜对口腔黏膜癌模型的作用，发现灵芝三萜能抑制血管内皮细胞的表达，起到抑制口腔黏膜癌的作用。钟志如等[27]通过研究破壁灵芝孢子粉联合他莫昔芬对人乳腺癌MCF-7细胞皮下移植瘤生长增殖的影响，研究发现破壁灵芝孢子粉联合他莫昔芬能够抑制肿瘤细胞增长及繁殖作用，并显著降低肿瘤P53的表达达到潜在的抗肿瘤转移作用。

3.5 降血脂血糖 灵芝孢子粉可以降低小鼠血清总胆固醇（TCHO）、血浆胆固醇、血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和血清甘油三酯（TG），表明灵芝孢子粉具有调节血脂的作用[28]。灵芝三萜（GLTs）是醛糖还原酶和α-葡糖苷酶的活性抑制剂，可抑制餐后高血糖，在糖尿病治疗中发挥重要作用。Fatmawati等[29]通过研究灵芝中羊毛甾烷型三萜类化合物作为α-葡糖苷酶抑制剂的构效关系，研究表明C-3处的OH取代基是重要特征，并且侧链中的羧基对于α-葡糖苷酶抑制活性的识别是必需的。

3.6 防治心血管疾病 赵东生等[30]以原位性高血压大鼠为对象进行研究表明，灵芝酸可提高超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，清除自由基、增加NO生成、抑制内皮细胞凋亡，改善和恢复内皮细胞功能，起到降压的作用。

3.7 缓解哮喘 通过皮肤试验和抗原特异性血清IgE检测鉴定每名哮喘患者的特异性过敏情况，各项指标表明灵芝酸β（GAβ）能有效恢复患者外周血单核细胞（PBMC）的Th1/Treg-Th2平衡，增加白细胞介素-5（IL-5）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素 -10（IL-10）和白细胞介素 -12（IL-12）水平[31]，使哮喘症状得到有效缓解。灵芝三萜中的某些化合物对由中性粒细胞等释放的炎症介质有抑制作用。在哮喘的鼠模型中，富含灵芝三萜的提取物显著减弱了气道高反应性，减少了总体粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润，减少了炎症介质的水平。

3.8 抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性 艾滋病毒是一种高度传染性的病毒，影响全球约3500万人。研究表明，从灵芝中提取分离得到三萜类物质（灵芝酸β、灵芝酚B、灵芝酮二醇、灵芝马酮和丹芝酸A），对HIV-1病毒、HIV-1蛋白酶均有一定的抑制作用，IC50在20～90 μmol/L[32]。在活性实验中还发现赤芝中的灵芝酸B和灵芝醇B对HIV-1蛋白酶有较强的抑制作用，从紫芝中分离到的灵芝醇F等对HIV-1蛋白酶也有较强的抑制效果IC50在20～40 μmol/L[33-34]。

3.9 抑制血小板聚集 药物抗血小板聚集是目前临床上治疗缺血性脑卒中的常用方式，刘玉莲等[35]研究灵芝孢子粉对高同型半胱氨酸血症(Hhcy)大鼠血液流变学的影响，与模型组相比，灵芝孢子粉能够降低血小板聚体率、血液黏度及体外血栓长度和湿重，差异有统计学意义（P＜0.05）。灵芝孢子粉对Hhcy大鼠有保护作用，其可能通过影响血液流变学相关指标而发挥药理作用。

3.10 防治癫痫 灵芝孢子粉可以增加海马神经元细胞的数量和保持细胞的形态，促进神经营养因子的表达、抑制神经系统中N-钙黏素的表达来保护海马神经元细胞，还通过降低癫痫大鼠神经生长因子（NGF）的过度表达发挥抗癫痫的作用[36]。Wang等[37]通过对癫痫患者回顾性研究探讨灵芝孢子粉治疗癫痫的可行性和安全性，结果表明灵芝孢子粉可能有效减少癫痫患者每周的发作频率。

4 GLST的应用

灵芝孢子粉对多种病症有辅助治疗作用[38]。临床肿瘤试验表明，灵芝孢子粉可以改善肺癌晚期患者的疲劳状况和提高生活质量[39]；在干预神经衰弱患者过程中，明显改善了患者的失眠多梦、健忘、烦躁等各种症状；可改善糖尿病患者的胰脏血液循环，降低血糖；可通过促进骨髓内细胞增生及成熟，达到补血作用和提高免疫机能的效果；可改善患者的失眠症状、改善肿瘤患者的精神及饮食情况等。灵芝三萜类化合物在制药领域有一定的应用，用于生产各类抗癌[40-41]、护肝[42-43]、抗氧化[44-45]、提高免疫力[46]和降血糖血脂类药物。

5 研究前景展望

近年来，国内外学者已对灵芝孢子粉进行了广泛的药理作用和保健功能的研究，对部分活性成分进行了提取分离、纯化和结构鉴定，不断有新的药理活性被报道，在新药开发、治疗佐剂、保健食品等方面展现出巨大的开发前景。同时随着灵芝种植规模的扩大，栽培技术和灵芝孢子收集技术的发展，破壁方法及分离技术的进步，对其研究将会不断深入，灵芝孢子粉更多的药理作用将会不断被发掘和证实，开发出新型药品和新型保健品，进一步推动灵芝孢子粉精深加工产品走向国际化。