预处理策略促进间充质干细胞修复急性肾损伤的机制研究进展

李雯婕，邓旖婷，谢天蔚，姜大朋

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是指48 h内肾功能急剧下降，血清肌酐(serum creatinine,Scr)上升，大于26.5 μmol/L或增加≥50%(达到基线值的1.5 倍)，尿量<0.5 mL/(kg·h)持续超过6 h[1]。一旦发生AKI，患者在重症监护室停留的时间和住院时间明显延长，病死率显著增加。AKI病因众多，病理生理学机制十分复杂。目前，AKI的治疗方案仍局限于透析和肾移植，高昂的费用和供体器官的短缺限制了这2种治疗方案的临床应用。而近几十年干细胞治疗领域的突破性进展为数百万AKI患者带来希望。研究表明，干细胞可以通过多种机制促进肾小管上皮细胞的修复。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其免疫原性低、多能分化能力高、隔离侵入并且分布广泛，在AKI治疗方面具有广泛的应用前景[2]。

虽然MSCs在动物模型中作用显著，但其与临床应用之间依然存在着巨大差距。2017年，Swaminathan等[3]选取心脏手术后发生AKI的患者，使用MSCs疗法进行了随机、双盲、多中心的2期临床试验(NCT01602328)。对随机选取的156名受试者进行研究后，发现两组患者的肾功能恢复所需要的时间、需要透析的比率和30 d死亡率均相近。为什么MSCs无法体现其优越性？Silva等[4]认为，MSCs临床作用局限性可能与植入量不足、存活率低、旁分泌能力受损有关。为解决这一问题，近年来研究者们探索出一系列提高MSCs作用的方法。作者就提高AKI中MSCs作用的方法进行总结，并分析影响MSCs疗效的各种因素。

1 提高MSCs存活率的措施

MSCs的低存活率使MSCs的治疗受到了很大影响，原因有移植后失巢凋亡、缺血、炎症、活性氧与抗氧化剂之间的失衡等[5,6]。以下预处理措施能够保护MSCs免受有害环境的干扰,提高MSCs的存活率。

1.1 与细胞因子或化合物一起培养 实验证明，多种细胞因子或化合物有细胞保护作用，通过一系列细胞信号转导通路提高细胞存活率来改善MSCs在AKI中的治疗效果。

1.1.1 细胞因子 研究表明，用胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)预处理MSCs能促进其增殖，减少凋亡。Xinaris等[7]用IGF-1预处理MSCs发现，在AKI模型中，肾内移植IGF-1预处理MSCs的数量在第1天显著增多，至第4天仍然维持较高水平，其部分原因是预处理MSCs对H2O2诱导的氧化损伤具有更强的抵抗力。

1.1.2 使用药物联合培养MSCs Cai等[8]发现，用阿托伐他汀预处理MSCs，通过抑制Toll样受体4信号的表达，植入MSCs的存活率显著提高。Mias等[5]向缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)诱导的AKI大鼠的肾实质内注射用褪黑素预处理的MSCs，其存活率显著提升，并通过诱导血管生成和肾细胞增殖，加快了肾功能的恢复。

1.2 改善微环境 体外扩增期间，一系列细胞表面分子的缺失使细胞间粘附能力下降[9]。Xu等[10]发现三维球体培养的MSCs能产生更多细胞外基质(extracellular material,ECM)，将其输入I/R诱导的AKI大鼠模型后，MSCs的存活率以及MSCs治疗AKI的效果均提高。

1.3 热敏水凝胶 移植后，失去与ECM锚定连接的MSCs在恶劣的细胞微环境中很容易发生失巢凋亡[11]。热敏水凝胶能改善微环境，提高移植细胞的存活率[12]。Gao等[13]用壳聚糖氯化物水凝胶作为细胞载体，将MSCs运送入I/R诱导的AKI大鼠体内，观察到水凝胶支架可以提高移植MSCs的存活率。

1.4 基因修饰 与其他处理措施相比，基因修饰是一个提高MSCs存活率更精确的方法。通过基因改造，使MSCs过表达细胞因子或抗细胞凋亡基因，提高其在受损组织中的存活率[14]。Liu等[15]构建了血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells-BMSCs)，发现HO-1-BMSCs在I/R诱导的AKI肾匀浆上清液(模拟AKI微环境)中存活率提高。

2 提高MSCs的旁分泌能力

分泌旁分泌介质是受损组织中MSCs再生的主要机制。MSCs可以分泌各种细胞因子、生长因子和蛋白质，发挥抗凋亡、免疫调节、抗氧化和促进血管再生的作用[16-18]。

2.1 低氧 实验证明，低氧预处理后的BMSCs移植能更有效改善I/R大鼠肾功能、修复肾脏组织损伤，其作用机制可能与低氧预处理促进BMSCs旁分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和碱性成纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等有关。Liu等[19]用200 μm/L氯化钴低氧预处理BMSCs 24 h，发现低氧预处理BMSCs移植组中，HGF和bFGF的水平相较于常氧培养BMSCs移植组均显著升高。目前研究认为，HGF、bFGF等细胞因子通过旁分泌作用，下调肾脏局部促炎细胞数量，上调抗炎细胞数量，降低局部促炎因子表达，从而抑制AKI相关炎症反应，促进肾损伤修复。

2.2 加入细胞因子或化合物联合培养 加入细胞因子或化合物联合培养也能提高MSCs的旁分泌能力。Bai等[20]用细胞因子白介素-17A预处理MSCs后，将其导入AKI大鼠体内，该组大鼠急性肾小管坏死评分、Scr和血尿素氮水平均显著下降。

2.3 改善培养条件 改善培养环境有助于提高MSCs的旁分泌能力。3D球状体培养MSCs促进了bFGF、HGF、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和肿瘤坏死因子诱导基因-6(tumor necrosis factor-inducible gene 6,TSG-6)的分泌[10]。

2.4 热敏水凝胶 热敏水凝胶不仅提高了MSCs的存活率，而且提高了其旁分泌能力。Feng等[21]表示，使用IGF-1C结构域(IGF-1C-domain,IGF-1C)修饰的壳聚糖水凝胶促进了IGF-1C、HGF和EGF的表达。

2.5 基因修饰 使用慢病毒载体使BMSCs中CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor,CXCR4)过表达，可以提高HGF、骨形态发生蛋白-7和白介素-10的表达水平，体内实验中也观察到肾功能明显改善[22]。此外，脂质运载蛋白-2(lipocalin 2,Lcn-2)在肾小管上皮细胞再生与增殖中发挥着重要作用，是对抗AKI的保护因子[23]。Roudkenar等[24]通过修饰MSCs基因上调Lcn-2的表达，促进HGF、IGF-1、VEGF和成纤维母细胞生长因子的分泌。

3 影响MSCs治疗AKI疗效的因素分析

由于MSCs的高度异质性和AKI的病理生理复杂性，MSCs最佳组织来源、细胞类型、AKI治疗剂量和时间等因素的变化，都能影响MSCs治疗AKI的疗效。

3.1 MSCs的类型与疗效 直至目前，BMSCs仍然是各种动物AKI模型中使用最广泛的一种MSCs，也是目前临床研究中唯一证实有效的MSCs。但BMSCs有其自身局限性，如相对侵袭性和数量限制[25]。诱导多能干细胞来源的MSCs(induced pluripotent stem cell-derived MSCs,iPSC-MSCs)是单克隆细胞系MSCs从iPSC分离出来的分支，iPSC的自我更新能力成为MSCs无限、无创的来源。iPSC-MSCs的应用可以解决一些临床“瓶颈”，如获得性MSCs的异质性、与供体细胞衰老相关的疾病等[26]。虽然研究人员已经研发出不使用病毒载体的诱导方法，但仍存在致癌风险。因此，需要更多的研究来证明何为AKI患者最好的选择。

3.2 MSCs的不同输送方式与疗效 在动物模型中，静脉注射、动脉注射、腹腔内注射和肾内注射是4个主要的输送方式。2013年的一项Meta分析证明，与腹腔内注射、静脉注射相比，动脉注射MSCs能使Scr明显下降[27]。由于Meta分析的局限性，很难明确哪一条输送途径对AKI的治疗是最好的。因此，作者需要更多的研究来解决这一问题。

3.3 异体和自体MSCs的疗效比较 截至目前，仅一项研究比较了AKI中异体和自体MSCs的安全性和有效性。给I/R诱导的AKI大鼠不同剂量的同种异体和自体MSCs，它们均发挥肾脏保护作用。此外，同种异体组中一系列纤维化相关基因表达减少，这或许提示异源MSCs的潜在疗效更好[28]。

4 总结和展望

总之，在临床AKI治疗中MSCs需要量取决于其存活率和旁分泌能力。各种预处理措施均提高了MSCs的存活率和旁分泌能力，但鉴于不同MSCs治疗方案之间的巨大差异性，很难证明哪一种预处理措施是最好的。根据MSCs的捐赠者、来源、路线时间和移植所需剂量的不同，需要调整相应的预处理措施。一个理想的AKI治疗方案不仅能提高MSCs的存活率和旁分泌能力，而且还要规避潜在的毒副作用。随着这一领域研究的不断深入，作者期待着MSCs治疗AKI的光明前景。