宏基因组学在感染性疾病诊治中的研究进展

王 硕，张志华

(承德医学院附属医院血液内科，河北 承德 067000)

近年来，mNGS正在从实验室研究发展阶段应用于临床实验室诊断，改变了临床医生诊断和治疗感染性疾病和肿瘤以及人类宿主基因表达异常(转录组)等各类疾病的方式。mNGS技术是将通用接头连接到要测序的片段化基因组DNA,然后使用不同的方法产生数千万的单分子多克隆聚合酶链反应阵列,然后进行大规模的引物杂交及酶延伸反应。2005年二代测序(Next-generation sequencing,NGS)技术的出现使宏基因组学迅速发展，这是第一次可以同时对几十万甚至几百万的读数进行测序,并且可以同时检测反应后每个步骤产生的信号,通过计算机分析获得完整的DNA序列信息以得到临床或环境样本的整个遗传内容[1]，测序成本降低推动了mNGS技术的普及，且因其检测速度快、准确率高、覆盖范围广等优势,具有良好的临床应用发展趋势，本文就mNGS的临床微生物学分析、病原体-宿主相互作用研究、肿瘤学和面临的挑战等方面进行综述。

1 临床宏基因组学的应用

1.1 病原微生物的鉴定：医学微生物学是研究微生物的形态、结构、分类和社会革命活动规律的一门科学，包括细菌学、病毒学、真菌学等。微生物学的传统实验室诊断技术包括培养鉴定、病原体的特异性抗体(血清)或抗原的检测及其核酸(DNA或RNA)的分子生物学鉴定，目前最常用的检测方法为PCR和RT-PCR(多聚酶链反应)。然而，分子生物学鉴定必须使用特定的引物或探针靶向鉴定特定的病原体，检测的病原体种类非常有限。宏基因组学可以检测样本中所有物种的DNA或RNA，能够快速分析患者样品中整体微生物群以及人类宿主基因组和转录组，因此，mNGS对于发现新型病原体并检测健康和患病状态下的人类具有显著优势。

文献表明目前仍有20%～60%的病例未检测到致病病原体[2]，基于高通量测序的宏基因组学研究给病原体的识别鉴定带来了新的方法和思路，mNGS可检测临床样本中病原体的全部基因信息，获得有关主要抗原和毒力基因，并进行病毒基因分型，实现对新兴病原体的识别、分型和溯源。Samarkos等通过全基因组序列的系统发育分析发现中国和美国的COVID-19的分离株聚集在同一系统进化枝中，并发现其与两种蝙蝠SARS样冠状病毒(Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL-CoVZXC21)的同源性为86.9%，故判断其为一种新型冠状病毒[3]，研究还发现中国和美国COVID-19分离株的基因组序列在核苷酸水平上的同源性高达99.8%至100%，判断其为同一种冠状病毒。综上，基于mNGS对COVID-19的全面分析一定能获得该病毒的起源、传播途径以及物种屏障等相关信息，进而为传染病的预防、控制提供依据。

1.2 病原微生物组学分析：mNGS正在逐渐取替16S rDNA基因的靶向测序，以实现我们对不同环境微生物组成的检测鉴定[4]。广谱抗生素长期大量应用和胃肠外科手术等多种因素导致肠道菌群比例失调，发生感染[5]，严重时可导致危及生命的暴发性伪膜性肠炎和中毒性巨结肠。其中治疗方法之一为粪便菌群移植，成功率高达80～90%，间接证明微生物组学研究有助于治疗艰难梭菌感染[6]。肠道宏基因组相关研究显示肠道菌群与肥胖、糖尿病、炎症性肠病等疾病密切相关，通过mNGS鉴定肠道菌群失衡有助于靶向菌群移植治疗[7]，此外，通过mNGS分析微生物组的多样性可以对宿主的健康和疾病状态进行评估，Boulange等发现不同肺部疾病的肺泡灌洗液具有不同的微生物群落[8]。以微生物为靶点,利用mNGS干预微生物组必将成为临床治疗新的探索方向。

1.3 病原体-宿主相互作用研究:mNGS基因表达分析具有互补作用，通过检测微生物表达产物的RNA-seq读数可以把感染、定植和活菌与死菌区别出来[9]，实现了包括葡萄球菌、白色念珠菌、结核和流感的诊断治疗[10～12]。基于病原体的特异性宿主反应也可用于诊断复杂感染病例，例如脓肿和呼吸道分泌物等。此外，对于测序结果的二次数据(即结合微生物和宿主基因表达数据)挖掘可提高临床诊断的准确性。

1.4 在肿瘤学中的应用:在肿瘤发生机制中，mNGS可鉴定与癌症相关的病毒(包括疱疹病毒、乳头瘤病毒、肝炎病毒、EB病毒等)和病毒-宿主相互作用的数据[13]。根据病毒感染及其参与的信号通路为靶向抗病毒和(或)化疗药物的使用提供信息[14]，丙型病毒性肝炎通过抗病毒治疗后肝癌的风险性降低。目前，临床mNGS主要应用于晚期肿瘤的用药指导，多基因、多位点突变的检测技术较传统检测手段具有显著优势。此外，肿瘤DNA变异在肿瘤早期或肿瘤负荷较小时便出现于血液中,通过对血液中的游离DNA的检测可以实现肿瘤的早期诊断或判断是否疾病进展，mNGS还可用于肿瘤术后的复发监测、诊断微小残留病灶等，为肿瘤患者的个体化诊疗提供依据。

2 临床应用面临的挑战

mNGS技术的不断完善正在推动精准医学模式的发展，该技术仍存在诸多问题限制其在病原体检测方面的应用和发展，首先，mNGS的测定结果缺乏重复性和质量保证，而且成本、报销问题也是临床mNGS实施的障碍,此外，mNGS的检测也是一项十分繁复的工作，需要定制质量管理以达到监管目的，另外，不规范的实验操作也可能引起外源性背景菌的污染从而增加诊断难度，故在临床应用之前，需进行重复性验证研究以获得可信度高的测序结果。

2.1 实验流程:mNGS检测前需要严格的样品处理方案以避免错误和交叉感染，包括样品收集、核酸提取、文库制备等过程，在上述过程中即使微量外源性DNA或RNA混进待测样本也可被检测出来从而干扰测序结果，由于样品处理的轻微偏差都会导致测序结果发生较大差异，所以需要将工作流程分为连续的几个步骤，工作人员只需负责自己的工作步骤，这样有助于避免实验错误，此外，背景微生物数据库(包括mNGS测序过程中检测到的正常微生物和污染产生的微生物)的建立至关重要，通过排除背景微生物以实现临床诊断，除此之外，还需要制定参考标准以确保mNGS的测序质量和实验结果的稳定性。

2.2 生物信息学技术:mNGS在我国临床感染性疾病的诊断中尚未普及,现有检测机构的测序方法，不仅生物信息算法存在差异,而且所用的数据库也有所不同,导致微生物的鉴定以及丰度计算方面均存在差别，为保证临床mNGS数据的准确性，必须对生物信息分析过程中每个数据处理步骤进行评估分析，包括计算机数据和临床样本数据。微生物基因组的公共数据库包括国家信息中心数据库(National Center for Information Biotechnology Information,NCBI)和华大基因数据库，对于目前临床mNGS应用来说，数据库的综合分析和整合更有利于数据的准确性，另外，需要对微生物测序读数设定阈值以明确具有临床意义的微生物。

mNGS对于感染性疾病的诊治方面具有不可忽略的临床应用价值，随着测序技术的发展，mNGS必将成为临床病原体检测的常规方法，为实现精准医疗做出贡献。