血凝和血凝抑制试验影响因素及解决方法

胡秋霞

（长葛市动物疫病预防控制中心，河南 长葛461500）

1 血凝试验中常见的问题

1.1 抗原的配制与标定

如果用冻干血凝抗原做试验时，要按照瓶签要求的量加入注射用水或灭菌用纯化水（有时加入0.9%生理盐水），摇匀静置备用。在反应板上同时做3份标定抗原效价，严格按照操作规程进行操作，在倍比稀释过程中避免产气溶胶，最好是每孔稀释次数一致，加入1%红细胞悬液时，边加边摇匀，然后放到微量振荡器上混合1 min，避免液体溅出。室温20～25 ℃静置20～30 min 或2～8 ℃45～60 min。在对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。

1.2 标定抗原效价的结果判定

将反应板倾斜60°，观察红细胞有无泪珠状流淌，凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%红细胞凝集这点很重要，如果终点孔中心有点状沉集，都对以后的试验有较大影响。

2 血凝抑制试验中常见问题

2.1 4单位抗原的制备

根据血凝效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。如抗原效价为1∶128，则应将抗原做256÷4=64倍稀释。

2.2 4单位抗原的校正

为保证4 单位抗原配制准确，需做回归试验。方法为：

2.2.1 首先用微量移液器向反应板的第2孔至第6孔加生理盐水25 μl，第1孔不加。

2.2.2 用微量移液器吸取4单位抗原25 μl分别加入第1孔、第2孔，从第2孔开始倍比稀释5～6次，然后吸出25 μl至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25 μl。

2.2.3 用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1～6孔，每孔25 μl。

2.2.4 于微量震荡器上震荡1 min，室温静置30 min 后观察结果。

2.2.5 结果观察：第1、2、3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果表明4单位抗原配制准确，校正成立。

2.2.6 通过多次试验比对证明，配制4 单位抗原后，按照血凝抑制试验操作规程测定标准阳性血清效价，血凝抗原和对照的阳性血清效价一般大于等于7 log 2，两者效价基本平行一致，相差±≤1 log 2滴度，此时也可证明4单位抗原配制准确。

2.3 待检血清的处理

新鲜的样品一般不需要处理，如果是冷冻保存的血清样品，解冻后出现分层现象时要摇匀才能用于检测。

2.4 血清对照

每次做HI 试验时，都要做阳性血清对照和阴性血清对照，不需要每板都做，一次做两份阳性和阴性血清对照即可，阳性对照孔血清误差不超过±1个滴度，阴性对照血清效价不高于2 log 2时，试验结果才有效。

2.5 加样品稀释过程中应注意的问题

倍比稀释过程中如果混合不均匀，也会使结果出现差异，用微量移液器吹打时避免产生气泡和液体的溅出，加4单位病毒抗原和1%红细胞悬液时要避免移液器的滴头与孔内的液体接触，为减少交叉污染，可以从低倍孔往高倍孔方向加样。加入1%红细胞悬液时要边摇边加，保证所加的样品量和浓度准确一致。4 单位样品配制后要在2h内用完。

2.6 反应温度和时间

加入抗原后20～25 ℃静置至少30 min，加入1%红细胞悬液后震荡混匀，静置20～30 min，根据对照孔红细胞呈明显钮扣状沉于孔底时迅速判定结果。

2.7 结果判定

将反应板倾斜，从背侧观察红细胞是否呈泪珠状流下，以完全抑制4单位抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的HI效价。当阳性对血清对照孔与已知效价误差不超过±1个滴度，阴性对照血清效价不高于2 log 2时，试验方可成立。

总的来说，只要1%红细胞悬液和4 单位病毒抗原配制准确，按照试验操作规程规范操作，一般情况下试验都会成立。出现问题时要认真分析，综合考虑各个环节的影响因素，及时总结为以后的试验积累数据和经验，只有这样才能不断提高实验室检测能力。