活血解毒降糖方对糖尿病大鼠动脉粥样硬化内质网应激的实验研究

糖尿病动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是慢性炎症相关的代谢性疾病，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是代谢异常与炎症反应之间的桥梁，2004年Ozcan 等[1]在Science发表文章指出，ERS是多种应激源的共同通路，是糖尿病胰岛素抵抗及其并发症发生发展的重要环节，因此，ERS可望成为治疗糖尿病的一个新靶点。尽管糖尿病AS发病机制复杂，但高糖、高脂、氧化应激状态、炎症反应等糖尿病的病理状态均与ERS有关，连接代谢异常和糖尿病发生发展的过程，可引起巨噬细胞和平滑肌细胞凋亡，参与糖尿病AS的发生与发展[2]。糖尿病和冠心病分别属于中医学消渴和胸痹范畴，消渴并胸痹在病机上存在气阴两虚、燥热内蕴，迁延日久，炼液成痰，阴损及阳，血凝为瘀，痰瘀内蕴久而成毒，因此气阴两虚、瘀毒内蕴是消渴并胸痹的主要病机[3]。本课题的前期临床研究发现，具有滋阴益气、活血解毒作用的活血解毒降糖方(Huoxue Jiedu Jiangtang Formulation，HJJF)，能明显降低促炎因子，调节抗炎/促炎平衡，能有效抑制糖尿病急性冠脉综合征(冠心病危重形式)非血运重建病人炎症反应，改善病人临床疗效[4]。本研究以大鼠为实验研究对象，从内质网应激偶联炎症反应机制，进一步探讨HJJF干预糖尿病AS发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 建立模型 体重220～250 g雄性SD大鼠120只，在室温 22～25 ℃，相对湿度40%～50%的实验室，进行分笼饲养，每笼4只。大鼠由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK(桂)2014-002。适应性普通饲料(江苏省协同生物工程有限公司)喂养7 d后，空腹10 h后， 腹腔内单次注射链脲佐菌素(北京华越洋生物科技有限公司)50 mg/kg，72 h后尾静脉采血，采用血糖试纸(武汉博士德生物工程有限公司)检测空腹血糖(FBG)，以连续2次FBG≥16.7 mmol/L 的大鼠作为糖尿病模型，随后进行高脂饲料(普通饲料78.2%，猪油10%，胆固醇1.5%，蛋黄粉10%，猪胆盐0.3%。江苏省协同生物工程有限公司供给)喂养3个月，每天记录进食量及饮水量。另设正常组(25只)，予腹腔内注射等量生理盐水，普通饲料喂养。

1.2 大鼠分组与给药 大鼠最后造模成功102只，随机进行分组，模型组25只，格列喹酮+贝那普利组(西药组)26只，HJJF低剂量组26只，HJJF高剂量组25只，并开始给药。活血解毒降糖方组方：人参、黄芪、麦冬、山茱萸、地黄、大黄、鳖甲、桃仁、丹皮、黄连、丹参、山药、五味子。购自右江民族医学院附属医院，制成浸膏，1 g相当于原生药10 g。低剂量组按1.0 g/(kg·d)、高剂量组按1.5 g/(kg·d)灌服活血解毒降糖方混悬液；西药组用格列喹酮(北京万辉双鹤药业有限责任公司)7.50 mg/kg和贝那普利(北京诺华制药有限公司)2.50 mg/kg，配成等体积溶液灌胃，共给药8周，并继续高脂饮料喂养；模型组仅给高脂喂养，正常组一直普通饲料喂养。实验操作均在超净工作台内进行。

1.3 取材 动物给药60 d后，禁食12 h，可饮水，再次对各组大鼠FBG检测后，用8%戊巴比妥钠，按2 mL/kg剂量腹腔注射麻醉，腹正中开腹，下腔静脉采血7～10 mL，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，用以指标检测；剥离主动脉，生理盐水冲洗，取胸主动脉，-80 ℃冷藏，用于RT-PCR 实验。

1.4 指标测定

1.4.1 血脂、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测 采用全自动生化仪测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG )、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD含量，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-6、TNF-α、GSH-Px水平，试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。具体实验步骤按试剂盒说明进行。

1.4.2 Rea1-time PCR法检测主动脉GRP78、JNKmRNA的转录水平 从-80 ℃冰箱取出主动脉，放入研钵中进行研磨，提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳后检测其完整性；按照反转录试剂盒说明书操作，先42 ℃ 50min再95℃ 5min逆转录为cDNA。将获得的cDNA作为模板进行PCR扩增目的基因(按照Rea1-time PCR试剂盒说明书操作)，内参基因和目的基因引物由上海吉凯基因公司设计合成，内参GAPDH上游引物为5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物为5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，扩增长度114 bp；GRP78上游引物为5′-CTTGGTATTGAAACTGTGGG-3′，下游引物为5′-TGTTACGGTGGGCTGATTAT-3′，扩增长度117 bp；JNK上游5′-GGATTTGGAGGAGCGAACTAA-3′，下游5′-ACTGCTGTCTGTATCCGAGGC-3′，扩增产物为163 bp。PCR循环参数为96 ℃4 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s三步反应，40个循环。记录达到所设定的阈值时所经历的循环数即CT值，利用溶解曲线检测引物的特异性，表达量的计算方法采用2-△△Ct法，△Ct=Ct目的基因-CtGAPDH，△△Ct= 实验组(Ct目的基因-CtGAPDH)-对照组(Ct目的基因-CtGAPDH)，2-△△Ct=2-△Ct实验组/2-△Ct对照组，具体计算时以对照组表达量为1，则比值即为实验组的相对表达量。

1.5 TUNEL法检测主动脉细胞凋亡 用TUNEL法检测主动脉细胞凋亡，试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司，把石蜡包埋的主动脉切成4 μm的薄片，行脱蜡，漂洗，加蛋白酶，室温15 min，加3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，室温1 min，加TUNEL液，37 ℃反应1 h，加过氧化物酶，加二氨基联苯胺(DAB)，室温10 min，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，最后树脂封片，光学显微镜下观察，正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕黄色，每张阳性切片选取5个阳性细胞最多的视野，计算阳性细胞所占的百分比，即细胞凋亡指数。

2 结 果

2.1 大鼠实验过程中变化情况 大鼠造模成功后，饮水量多，尿量多，体重有所减轻，毛色枯黄，行动迟缓，反应迟钝，但灌药实验过程中无大鼠死亡。

2.2 活血解毒降糖方对大鼠FBG、SOD、GSH-Px、TNF-α和IL-6活性的影响 与模型组相比，各给药组FBG明显降低(P<0.05)，抗氧化酶SOD、GSH-Px升高(P<0.05)，炎症因子TNF-α、IL-6降低(P<0.05)；HJJF高低量组较西药组疗效好，并随HJJF剂量增加效果更显著(P<0.05)，但HJJF高低量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 活血解毒降糖方对大鼠FBG、SOD、GSH-Px、TNF-α和IL-6活性影响的比较(±s)

与正常组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与西药组比较，3)P<0.05

2.3 活血解毒降糖方对大鼠血脂的影响 与正常组相比，模型组大鼠TC、TG、LDL-C含量均显著升高(P<0.01)，HDL-C明显下降(P<0.01)；与模型组比较，给药后各组大鼠的TC、TG、LDL-C含量均降低，HDL-C含量均升高(P<0.05)，HJJF组疗效随剂量增加更显著，差异有统计学意义(P<0.05)；HJJF高、低剂量组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 活血解毒降糖方对大鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C的影响(±s) mmol/L

与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05；与西药组比较，3)P<0.05

2.4 活血解毒降糖方对大鼠主动脉GRP78、JNK mRNA转录水平的影响 与正常组相比，模型组大鼠的GRP78、JNK mRNA表达均显著升高(P<0.01)；给药后，与模型组相比，各给药组的GRP78、JNK mRNA转录均降低(P<0.05)；与西药组比较，HJJF组降低效果更显著(P<0.05)；HJJF随剂量增加疗效更好，但HJJF高低剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3、图1。

表3 各组大鼠主动脉GRP78、JNK mRNA相对转录水平比较(2-△△Ct，±s)

与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05；与西药组比较，3)P<0.05

图1 主动脉GRP78、JNK mRNA的扩增曲线和溶解曲线

2.5 活血解毒降糖方对主动脉细胞凋亡的影响 正常细胞核呈蓝色，TUNEL阳性染色定位于细胞核内，呈棕黄色，体积等于或小于正常细胞核。原位主动脉细胞凋亡检测结果显示，与正常组相比，模型组可见大量的细胞凋亡(P<0.01)；与模型组相比，各给药组细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)；与西药组相比，HJJF高剂量组凋亡指数降低明显(P<0.05)；HJJF随增加剂量效果更明显，但HJJF高低剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2、表4。

图2 各组主动脉细胞凋亡切片图(×200)

表4 各组大鼠主动脉细胞凋亡指数的比较(±s)

与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05；与西药组比较，3)P<0.05

3 讨 论

内质网是蛋白质和类固醇合成的细胞器，当内质网稳态失衡导致蛋白质折叠错误及脂质合成紊乱而堆积时，将引发细胞内一系列的应激反应，称为ERS[5]。糖调节蛋白-78(glucose-regulated protein 78，GRP78)是内质网稳态的感受分子，当内质网处于稳态时分别与暴露于内质网腔中活化转录因子-6(ATF6)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和肌醇需求酶1(IRE-l)的结构域结合；在持续而严重的内质网应激发生时，由于GRP78与未折叠的蛋白质具有更高的亲和力，GRP78将与PERK、ATF6、IRE-1解离，解离后的PERK、ATF6和IRE则激活下游的CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(Caspase12)、c-JUN氨酸末端激酶(JNK)3个凋亡信号通路，导致细胞凋亡[6]。在JNK途径中，IRE-1被激活后，通过其胞浆内结合域与肿瘤坏死因子受体相关因子 2(tumor necrosis fector receptor associated factor 2，TRAF2)相结合，形成IRE-1-TRAF2复合物，转而激活下游的凋亡信号调控激酶-1( apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)，并与ASK1共同形成IRE-1-TRAF2-ASK1复合物，使JNK磷酸化而被激活，活化的JNK则抑制Bcl-2的抗凋亡活性，增强BIM的促凋亡功能，还参与Caspase-12的调节，磷酸化修饰CHOP，通过调节CHOP活性，增加彼此的促凋亡效果[6-7]。活化的JNK，还可活化转录活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)，增加促炎因子基因的表达，IRE1α-TRAF2复合物还可使IκB磷酸化并降解，释放核转录因子-κB(NF-κB)入核，激活炎症因子基因的转录[8-9]，导致促炎因子(TNF-α、IL-6等)的增加，增进粥样斑块的易损性[10]。对经皮腔内斑块旋切术所取得的样本中发现了内质网分子伴侣的大量表达，并且发现在不稳定斑块内ERS凋亡途径被激活[11]。糖尿病导致体内糖代谢正常途径受损，多元醇途径、蛋白激酶C(PKC)途径、晚期糖基化终末产物(AGEs)途径和己糖胺途径等4条旁路代谢通路过度激活，增强了还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性，在细胞内产生过量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[12]。ROS的蓄积影响内质网的稳态，使得蛋白质的空间结构折叠受阻致使未折叠蛋白蓄积诱发ERS[8]。另外，由于胰岛素抵抗的作用使脂蛋白脂酶的作用受损，极低密度脂蛋白(VLDL)的清除率下降，高胰岛素血症又促进肝脏合成VLDL，呈现TG和LDL-C增高，而HDL-C降低，脂质代谢紊乱。增强的氧化应激，使LDL-C氧化为氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，不能被LDL-C受体识别进行正常的降解，且与巨噬细胞清道夫受体有高度的亲和力，这一过程无负反馈机制，导致巨噬细胞中胆固醇酯大量聚积[13]，引发ERS，ERS又可加剧炎症反应，形成恶性循环。因此，内质网应激偶联炎症反应在糖尿病动脉粥样硬化发生发展中起着重要的作用，研究发现胰岛素抵抗可以使巨噬细胞对内质网应激介导的凋亡更加敏感，引起炎症反应、巨噬细胞和平滑肌细胞凋亡等，促进动脉粥样硬化的发生与发展[14-15]。抗氧化酶系统是机体抗氧化损伤的重要屏障，该系统主要包括GSH-Px、SOD等。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，它能催化还原型谷胱甘肽(GSH)变为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，为生物体中清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒酶。SOD是体内超氧阴离子的天然抗氧化酶，在对抗氧化损伤方面具有重要作用，GSH-Px和SOD二者的协同作用，均对抗糖尿病生成过多的ROS。

根据中医学理论，气阴两虚、燥热内蕴是糖尿病AS的基本病机，气虚致瘀，阴虚加剧内热，热瘀内蕴可化毒，痰瘀互结日久可成“积”(动脉粥样硬化斑块)[16]。同时，因为炎症反应是AS发生、发展及造成斑块不稳定引发急性心血管事件的主要原因，炎性反应引起炎症细胞浸润及炎性介质的释放，与热毒的本性特点相似，提示清热解毒药物可通过抗炎起到潜在的稳定斑块作用。因此，“益气养阴，活血解毒，软坚消积”是糖尿病AS的重要治法。活血解毒降糖方由人参、黄芪、麦冬、山茱萸、地黄、大黄、黄连、丹参、山药、五味子、鳖甲、桃仁、丹皮所组成，其中人参、麦冬、五味子是金元医家李杲名著《内外伤辨惑论》的滋阴益气名方生脉散成分；地黄、山茱萸、山药是明朝医家张景岳治疗真阴不足的左归丸成分；大黄、鳖甲、桃仁、丹皮是东汉张仲景《金匮要略》解毒软坚消积鳖甲煎丸的主要成分。再加丹参活血散瘀，黄连清热燥湿解毒，黄芪益气扶正解毒。从益气、滋阴、活血化瘀、清热解毒、软坚散结中药相配伍的方案寻求治疗思路，这是治疗糖尿病AS的创新。临床研究发现，活血解毒降糖方能抑制胰岛素抵抗，调节抗炎/促炎平衡，抑制糖尿病AS病人肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，能有效抑制糖尿病AS血运重建及非血运重建病人炎症反应，发挥多环节、多途径、多靶点的整体调节作用，提高临床疗效，改善心功能[4，17]。

本研究表明，糖尿病造模成功后GSH-Px受到一定程度的激活，代偿增高，但仍不足以抵抗高糖引发的氧化应激反应。给予药物干预后，均能明显降低FBG，升高SOD、GSH-Px；均可纠正脂质代谢紊乱(TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高)；均可降低促炎因子(TNF-α、IL-6)水平，下调内质网凋亡信号分子GRP78、JNK mRNA的转录水平和减少主动脉细胞凋亡。且HJJF组治疗效果较西药组疗效好，并随增加HJJF剂量效果更显著。

活血解毒降糖方的治疗作用在于，纠正机体胰岛素抵抗，纠正脂质代谢紊乱，提高抗氧化应激能力，减轻炎症反应，抑制“氧化应激-内质网应激-炎症反应-细胞凋亡”的偶联反应，减轻动脉硬化斑块炎症反应，从而减轻糖尿病合并动脉粥样硬化斑块的形成，体现了中医药整体干预、动态调整、多靶点治疗的防治特色。