蜂胶抗光老化功效

黄莺莺, 张翠平, 张言政, 胡福良

(浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058)

皮肤暴露在紫外线照射下时，细胞内会生成过量的活性氧(ROS)[1]，引起衰老相关基因表达[2]，诱发炎症级联反应并降低弹力蛋白和胶原蛋白的表达量[3]，导致皮肤出现松弛、皱纹等老化现象[4-6].皮肤抗光老化过程中基因的表达实际上是保护基因与损伤基因的共同表达.保护基因主要包括基质金属蛋白酶(MMPs)家族蛋白的抑制基因以及细胞凋亡的抑制基因[7,8]，而损伤基因主要包括胶原蛋白降解相关基因和弹性蛋白降解相关基因.基质金属蛋白酶-1(MMP-1)是降解Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白最重要的酶[9]，当皮肤细胞过量表达MMP-1时，真皮层细胞外基质的结构被严重破坏[10]，尤其是胶原纤维和弹力纤维的正常结构受到严重影响[11]，因此MMP-1是导致皮肤出现皱纹、细纹等衰老症状最主要的酶[12].MMP-1释放量是评价光老化的主要指标.ROS含量的增多会加速细胞凋亡甚至死亡的速率[13].皮肤在光老化过程中，UV的照射可以导致皮肤细胞内生成过量ROS，进而引起皮肤组织多种生物学效应[14]，如：MMP-1的过量表达[15]，细胞凋亡，抗氧化酶表达的降低等[16].因此，ROS含量也是评价光老化程度的重要指标.

蜂胶又被称为紫色黄金，含有丰富的黄酮类物质，黄酮类物质是有效的抗氧化剂，能够清除自由基，从而保护细胞免受自由基损伤[17]，蜂胶黄酮可以防止脑组织自由基过氧化而造成损伤[18].蜂胶中含有的咖啡酸苯乙酯也具有很强的抗氧化活性[19].蜂胶的抗氧化机制主要是通过直接或间接调节机体ROS的途径以调节体内氧化—还原平衡，并通过其他方式调节各种酶的活性和含量[20].迄今为止，蜂胶已被证实具有抗氧化、清除自由基及免疫调节等多种作用，但对其延缓皮肤光老化的研究报道尚不多见.本研究基于UVA辐照成纤维细胞的氧化损伤模型，通过分析蜂胶对ROS清除率、氧化相关基因MMP-1表达情况以及MMP-1含量等作用来评价蜂胶的延缓皮肤衰老功效，为蜂胶在皮肤光老化方面的开发应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂胶浸膏由杨属型蜂胶(产地为河南)经无水乙醇提取干燥制得，深褐色固体，具有特殊芳香味，于-20 ℃冷冻储存.

成纤维细胞，由广东博溪生物科技有限公司通过细胞原代、传代培养获得；低糖DMEM培养液(Gibco)、PBS(博士德)、MTT(Sigma)、DMSO(Sigma)、新生牛血清(四季青)、引物(TaKaRa)、RNA提取试剂盒(TaKaRa)、反转录试剂盒(TaKaRa)、荧光染料(TaKaRa)、ROS检测试剂(Invitrogen)、ELISA 试剂盒(Abcam).

蜂胶乙醇样品：蜂胶浓度为5%，用75%乙醇溶解蜂胶浸膏制得，棕黑色液体，室温保存；蜂胶聚乙二醇样品：蜂胶浓度为5%，用75%聚乙二醇溶解蜂胶制得，棕黑色液体，室温保存.

1.2 仪器与设备

分析天平(Denver TB-215D)、Milli-Q Intergral 纯水/超纯水一体化系统(Merk Millipore)、高效液相色谱仪(安捷伦1200)、CO2培养箱(Thermo)、超净工作台(苏净安泰)、倒置显微镜(Olympus)、微量振荡器(其林贝尔)、酶标仪(BioTek)、PCR仪(伯乐)、荧光定量PCR仪(伯乐)、恒温箱(泰斯特)、流式细胞仪(BECKMAN).

1.3 蜂胶化学成分分析

将蜂胶浸膏配置成5 mg·mL-1的乙醇溶液，滤膜除杂后放入高效液相色谱仪中分析检测，条件如下：

色谱柱：Sepax HP-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-1%乙酸；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：280 nm；柱温：36 ℃；进样量：2 μL；

梯度洗脱程序为：0～25 min，20%～40%甲醇；25～55 min，40%～55%甲醇；55～70 min，55%甲醇；70～85 min，55%～100%甲醇.

1.4 基于人成纤维细胞的细胞毒性检测

该试验共2个样品，设定8个浓度梯度，每个浓度下设置3个重复孔，同时，试验设置溶剂对照孔、调零孔(含10%新生牛血清低糖DMEM培养液)、阳性对照孔(8% DMSO).本试验通过MTT法检测细胞活力，筛选细胞给药的最大安全浓度.具体操作步骤如下：

制备细胞悬液，将对数生长期的细胞消化后接种到96孔板.两种蜂胶液样品分别配置不同浓度(0.005%、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%、0.31%、0.63%)的受试物.待细胞铺板率达到40%～60%时进行给药.给药完成后将平板放置在37 ℃、5%的CO2培养箱中培养.细胞孵育培养24 h，弃掉上清，加入MTT工作液，37 ℃避光孵育.4 h后弃去上清液，向各孔中加入150 μL二甲基亚砜，用酶标仪读取D490 nm值.

1.5 基于人成纤维细胞的抗光老化功效检测

抗老化效果测试是基于UVA辐照成纤维细胞的氧化损伤模型，通过分析ROS抑制率、氧化相关基因MMP-1表达情况以及MMP-1含量来评价待测活性物的功效，试验设计如表1.

1.5.1 ROS抑制率检测 取对数生长期细胞消化后接种至6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h.根据表1试验设计，配置不同浓度的受试物.待6孔板中细胞铺板率达到约40%时，进行分组给药，每组设3个复孔.37 ℃、5%的CO2培养箱中孵育培养24 h.根据试验分组，空白对照组直接进行ROS活性检测；其余组采用剂量为10 J·cm-2的UVA进行辐照.辐照结束后，直接进行ROS活性检测.PBS清洗细胞后，每孔加入1 mL浓度为25 μmol·L-1DCFH-DA探针，37 ℃细胞培养箱孵育45 min；弃掉含DCFH-DA的培养液，用PBS清洗多次，胰酶消化细胞后，PBS清洗细胞1次，加入一定量新鲜PBS，流式检测.汇总各组DCFH-DA Intensity(平均荧光强度)，用T-Test方法对进行统计分析.

表1 抗光老化功效试验设计1)Table 1 Experimental design of anti-photoaging test

1)PC(VE)作为ROS检测时阳性对照.

1.5.2MMP-1基因表达检测 基于细胞毒性检测的结果，选择安全浓度进行MMP-1基因表达检测.待给药24 h后收集细胞，通过qRT-PCR检测样品对细胞内MMP-1基因表达的影响.具体操作步骤如下：

表2 MMP-1基因表达检测引物序列及内参基因序列Table 2 Primers for MMP-1 expression and GAPDH genes sequences

取对数生长期细胞消化后接种至6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h.按试验设计(表2)配置不同浓度的受试物.培养结束后，收集细胞培养液用于下一步ELISA检测.用PBS轻柔清洗细胞3次，使用RNA isoPlus裂解细胞，每孔加入1 mL裂解液.室温放置5 min，使其充分裂解，转移至1.5 mL RNase-free Eppendorf管中，提取RNA，合成cDNA，进行Elastin基因表达检测.采用2-△△Ct计算方法进行数据处理，使用T-Test方法进行统计分析.将空白对照组mRNA扩增倍数归一处理，样品组与空白对照组相比，显著性以*表示，P<0.05表示差异显著，标注为*，P<0.01表示差异极显著，标注为**.

1.5.3 MMP-1含量检测 收集1.4.2中细胞培养液于1.5 mL EP管中，用于MMP-1 ELISA检测.收集的培养液1 000 g离心后吸取上清-20 ℃保存，进行MMP-1蛋白ELISA检测.标准品每组设计2个平行孔，样品每组设计3个平行孔.

2 结果与分析

2.1 蜂胶浸膏的HPLC分析

蜂胶浸膏的高效液相色谱测定结果见图1.本试验所用蜂胶浸膏中峰高最高的5种黄酮单体为短叶松素、松属素、短叶松素-3-乙酸酯、白杨素和高良姜素.在蜂胶浸膏中的含量分别为短叶松素3.57%、松属素4.61%、短叶松素-3-乙酸酯7.62%、白杨素5.16%、高良姜素2.07%.

2.2 细胞毒性检测结果

2.2.1 MTT检测结果 样品由高到低设定8个给药浓度，在人成纤维细胞上开展细胞毒性检测试验，细胞毒性检测结果及细胞活力变化趋势见图2.

以样品所选8个浓度为横坐标，人成纤维细胞相对活力值为纵坐标，绘制细胞相对活力曲线.选取细胞相对活力值大于90%的转折点浓度作为最大安全给药浓度.根据MTT试验结果可以看出：与溶剂对照相比，当蜂胶乙醇溶液样品浓度为0.08%时，细胞相对活力值为128.27%，无细胞毒性；当蜂胶聚乙二醇溶液样品浓度为0.08%时，细胞相对活力值为126.16%，无细胞毒性.

2.2.2 形态学检测结果 基于MTT试验结果，选择5个浓度进行形态学检测，检测结果见图3和图4.

根据形态学结果可以看出：蜂胶乙醇溶液和蜂胶聚乙二醇溶液样品浓度为0.08%时，细胞边缘轮廓清晰，形态规则，胞内无明显颗粒物，与溶剂对照组细胞状态无明显差异.故根据MTT结果和形态学结果，最终确定蜂胶乙醇溶液和蜂胶聚乙二醇溶液样品基于人成纤维细胞的最大安全给药浓度不超过0.08%.

2.3 抗光老化功效检测结果

2.3.1 ROS抑制率检测结果 基于UVA刺激人成纤维细胞的氧化损伤模型，通过检测ROS含量的变化来判定待测活性物的抗氧化功效，ROS检测结果和ROS抑制率分析见图5.

试验结果显示，与未辐照BC组相比，UVA辐照后ROS含量极显著增加(P<0.01)，表明氧化损伤模型造模成功；与UVA辐照组相比，PC组VE极显著降低了ROS含量(P<0.01)，蜂胶乙醇溶液样品在0.08%的给药浓度时，ROS含量极显著降低(P<0.01)，ROS抑制率13.39%。蜂胶聚乙二醇溶液样品在0.08%的给药浓度时，ROS含量显著降低(P<0.05)，其抑制率为11%，说明样品具有清除ROS而达到抗氧化的作用.

2.3.2MMP-1基因表达及MMP-1含量检测结果 对样品作用24 h后的人成纤维细胞进行UVA辐照(10 J·cm-2)，辐照后孵育24 h，用RNAiso Plus处理后收样，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR操作，收集细胞培养液，离心收集上清进行ELISA检测.MMP-1基因表达检测结果及MMP-1含量检测结果如图6所示.

与空白对照BC组相比，阴性对照NC组经UVA辐照后，MMP-1表达量和MMP-1含量极显著上升(P<0.01)，表明UVA造模成功；与阴性对照NC(UVA辐照)相比，2个样品组的MMP-1表达量均显著下调(P<0.05)，对MMP-1基因水平表达有抑制作用；2个样品组MMP-1含量均极显著下调(P<0.01)，其中蜂胶乙醇溶液处理组MMP-1含量低于未辐照的BC组.以上结果表明，蜂胶乙醇与蜂胶聚乙二醇样品均在0.08%的浓度下能够抑制MMP-1的合成，因此2个样品可以通过抑制MMP-1的表达而达到抑制胞外基质ECM的降解，从而起到一定的抗光老化功效.

3 讨论

与阴性对照NC(UVA+)组相比，蜂胶乙醇溶液和蜂胶聚乙二醇溶液均在0.08%给药浓度下，对ROS含量有极显著的下调作用；并且能显著下调人成纤维细胞中氧化相关的MMP-1基因表达量；对MMP-1含量有极显著下调作用.结果表明，蜂胶乙醇溶液和蜂胶聚乙二醇溶液一方面通过清除活性氧ROS防止自由基诱导的皮肤老化的产生，另一方面对MMP-1在基因水平和蛋白水平都具有显著性的抑制作用，进而通过抑制胶原等胞外基质的降解而达到抗光老化的效果.与75%聚乙二醇作为溶剂相比，以75%乙醇作为溶剂溶解蜂胶对ROS抑制率更高、氧化相关基因MMP-1 mRNA的表达量更少、MMP-1含量更低；可以推测蜂胶乙醇溶液比蜂胶聚乙二醇溶液具有更高的抗光老化活性.

目前，预防和延缓皮肤衰老已成为医学、化妆品和生物材料领域的研究热点之一.皮肤的衰老可以分为内在因素引起的内源性衰老和继发于外在因素导致的外源性衰老，其中紫外线辐射是最主要的因素[21].安全、有效的防治光老化产品开发是相关产业研究的重要方向.本研究有望为医药、化妆品行业开发改善皮肤光老化产品提供新思路，促进蜂产品行业的进一步发展.但是目前的研究依然存一些不足.首先，对蜂胶活性成分黄酮类物质、酚酸类及萜烯类物质等抗光老化的研究较少.其次，现阶段对凋亡相关基因和衰老相关指标，如细胞周期、线粒体融合蛋白、氧化应激相关基因表达等研究尚有不足.蜂胶对机体的保护作用机制复杂，对整个机体起到协调作用，而不是简单的对某种物质或信号通路的抑制或促进作用.蜂胶能否应用于抗光老化的预防和治疗仍需大量深入的研究.