蜂王浆对阿尔兹海默症SH-SY5Y细胞模型抗氧化功能的影响

路晨玥, 林 焱, 苏松坤

(福建农林大学蜂学学院，福建 福州 350002)

阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease, AD)是最常见的痴呆类型，年龄增长是引起该病症的主要原因.据研究数据统计，65周岁以上的人群中，AD发病率达10%～15%，随着年龄增长，85周岁的老年人患病率达30%以上[1].至今全球有5 000万人患有痴呆症，预估耗费约1万亿美元[2].中国是世界上人均寿命最长(目前的平均寿命约为84岁)、老年人比例最高的国家[3].随着人口老龄化日趋严重，AD患者将逐年增加，因此，该病引起了各界的关注和重视.

AD的发病机理复杂，至今仍未明确其根本病因.AD在医学上的主要病理特征之一是细胞内的神经纤维缠结，而微管相关蛋白tau的超磷酸化是AD患者脑中双螺旋纤维的主要组成物质，大量聚集沉淀便形成神经纤维缠结[4].SH-SY5Y是来自骨瘤转移灶的神经母细胞瘤细胞，具有神经元细胞的形态特点，且tau蛋白、调节tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的含量较高[5]，被广泛应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制方面的研究.OA是一种蛋白磷酸酶抑制剂，可抑制磷酸酶的活性，并提高微管相关蛋白tau蛋白的磷酸化程度，对细胞造成氧化损伤[6].体内外试验表明，OA能诱导神经细胞中的tau蛋白发生磷酸化，使神经细胞形态发生改变[7-9]，因此OA损伤的SH-SY5Y细胞是常用的AD细胞模型，多用于研究AD的病理机制和药物作用.实际上，AD病因复杂，除神经纤维缠结外，还与炎症反应和氧化应激反应等密切相关.蜂王浆(royal jelly, RJ)具有抗炎、抗氧化、调节血脂等功效，长期服用RJ，可能会对AD的抗氧化作用有积极影响，因此研究RJ对AD的作用，对于RJ的功能开发和应用具有重要意义.本研究通过3个指标SOD、MDA和ROS评估RJ对OA诱导损伤的阿尔兹海默症SH-SY5Y细胞模型的抗氧化作用，以探究RJ对该AD细胞模型是否有抗氧化功效.

1 材料与方法

1.1 蜂王浆与细胞

本试验所用的蜂王浆为江苏句容夏季采集的意大利蜜蜂王浆；SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞购自上海中桥新舟生物科技有限公司.

1.2 试剂

SH-SY5Y细胞专用完全培养基和不完全培养基(ZQ-1205)购自上海中桥新舟生物科技有限公司；OA(LK30S49)购自北京百威灵科技有限公司；分析纯二甲基亚砜(DMSO, 20160601)购自国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶(2046777)购自美国Gibco公司；CCK试剂盒(M10124)和BCA蛋白定量试剂盒(M20929)购自北京全式金生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(微量法)和丙二醛(MDA)试剂盒(微量法)购自苏州科铭生物技术有限公司；活性氧(ROS)检测试剂盒(070918181105)购自上海碧云天生物技术有限公司.

1.3 仪器

CO2培养箱(C150)购自BINDER公司；台式低速离心机(TDZ4-WS)购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；生物安全柜(HFsafe-1500 A2)购自上海力申科学仪器有限公司；恒温水槽与水浴锅(BWS-5)购自上海一恒科学仪器有限公司；酶联免疫检测仪(Infinite F50)购自Tecan(上海)贸易有限公司；超声波细胞粉碎机(SCIENTZ-IID)购自宁波新芝生物科技股份有限公司；流式细胞仪(C6 PLUS)购自美国BD公司；倒置显微镜(Nikon ECLIPSE TS100)购自日本Nikon公司.

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞培养于含44% MEM、44% F-12、10% FBS、1% PS、1% SP的SH-SY5Y完全培养基中，置于5% CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱内培养.

1.4.2 OA使用浓度和损伤时间的筛选 将50 μg OA溶解于6 mL DMSO中配制成10 μmol·L-1母液存放于-80 ℃保存备用.临用前使用SH-SY5Y完全培养基对OA母液进行稀释.将SH-SY5Y细胞用胰蛋白酶消化后稀释细胞至浓度1.5×105个·mL-1，接种于细胞96孔培养板中(每孔100 μL)，放入培养箱，待细胞贴壁后(约24 h)吸弃培养基，每孔加入100 μL不同浓度的OA溶液(30、40、50、60、70 nmol·L-1)，对照组加入等体积的SH-SY5Y完全培养基，每个浓度8个复孔，分别培养12、24 h后每孔加入10 μL CCK溶液于培养箱中继续培养4 h，用酶标仪测定492 nm处的吸光值，试验重复3次.

1.4.3 不同含量蜂王浆对OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞活度的影响 将SH-SY5Y细胞用胰蛋白酶消化后，稀释细胞至浓度1×105个·mL-1，接种于细胞96孔培养板中(每孔100 μL)，放入培养箱，待细胞贴壁后(约24 h)，吸弃培养基，每孔加入100 μL 40 nmol·L-1OA溶液，损伤24 h后吸弃OA溶液，每孔加入100 μL不同含量的RJ溶液(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·mL-1)，RJ溶液由SH-SY5Y不完全培养基(44% MEM、44% F-12、1% PS、1% SP)配制，对照组加入等体积的SH-SY5Y不完全培养基，每个含量8个复孔，继续培养24、48、72 h后，每孔加入CCK溶液10 μL，于培养箱中继续培养4 h，用酶标仪测定492 nm处的吸光值，试验重复3次.同时对比在RJ作用下，受OA损伤的SH-SY5Y细胞的形态差异.

1.4.4 细胞中SOD和MDA的含量检测 将SH-SY5Y细胞用胰蛋白酶消化后稀释细胞至浓度5×105个·mL-1，接种于细胞6孔培养板中，每孔2 mL，放入37 ℃培养箱，24 h待细胞贴壁后，吸弃培养基，每孔加入2 mL 40 nmol·L-1OA溶液，损伤24 h后吸弃OA溶液，每孔加入2 mL用SH-SY5Y不完全培养基配制的不同含量的RJ溶液(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·mL-1)，对照组加入等体积的SH-SY5Y不完全培养基，每个浓度3个复孔，继续培养24、48、72 h后，收集细胞到离心管内，1000 r·min-1离心10 min后弃上清，分别加入600 μL SOD、MDA提取液重悬细胞，超声波破碎细胞(冰浴，功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复30次)后，8 000 r·min-1离心10 min(4 ℃)，取上清置冰上待测.按照试剂盒说明书的步骤和用量将相关试剂与待测液混合后，将混合液室温放置30 min， 595 nm波长处测定吸光值，计算SOD含量；将混合液95 ℃水浴30 min后，492、595 nm波长处测定吸光值，计算 MDA.试验重复3次.

1.4.5 细胞中ROS含量的检测 细胞铺板、OA损伤和RJ处理同1.4.4.按照1∶1 000用不完全培养基稀释荧光探针DCFH-DA，使终浓度为10 μmol·L-1，细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，培养箱内孵育20 min，再用不完全培养基洗涤细胞3次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，最后用流式细胞仪检测得到Mean值.

1.5 统计分析

流式细胞仪检测ROS的结果，使用BD Accuri C6 Plus软件进行处理与分析.采用Graph Pad Prism 5.0软件处理试验数据.单因素多组数据采用one-way ANOVA方差分析.

2 结果与分析

2.1 OA使用浓度和损伤时间对细胞活度的影响

图1为CCK法测定得到的不同浓度OA诱导损伤SH-SY5Y细胞12、24 h的细胞活度.不同浓度的OA损伤SH-SY5Y细胞12 h时，细胞活度与对照组相比均有所升高，不同浓度的OA损伤SH-SY5Y细胞24 h时，细胞活度与对照组相比均有明显下降(图1).结果表明，OA损伤SH-SY5Y细胞24 h效果更好；同时，有研究通过蛋白免疫印迹确定40 nmol·L-1浓度的OA损伤SH-SY5Y细胞24 h， tau蛋白Ser-396位点磷酸化水平达到峰值[4]，所以最终选定40 nmol·L-1的OA损伤24h构建SH-SY5Y细胞损伤模型.以下试验都采用此损伤时间和损伤浓度.

2.2 OA损伤前后SH-SY5Y细胞的形态变化

正常SH-SY5Y细胞具有神经元细胞的形态特点，为贴壁细胞，锥形，细胞突触较长，具有明显轴突，饱满有光泽(图2A).经过OA损伤的SH-SY5Y细胞变为悬浮细胞，突触消失变圆，细胞皱缩(图2B).

2.3 不同含量RJ对OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞活度的影响

RJ在24、48和72 h对OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞活度都有促进效果，且在2或4 mg·mL-1处效果最佳，在16 mg·mL-1处细胞活度较低或细胞死亡(图3).一定含量的RJ可提高OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞活度，含量由低到高呈现出细胞活度先升高再降低的趋势，24、72 h最适含量为2 mg·mL-1，48 h为4 mg·mL-1，且2和4 mg·mL-1RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞48和72 h后，细胞活度均高于正常组细胞，说明特定含量RJ可显著促进OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞生长.

2.4 RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞形态特征变化

图4为2 mg·mL-1RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞24 h后，与图2B相比SH-SY5Y细胞受OA损伤消失的突触重新出现，并部分细胞贴壁.

2.5 细胞中SOD含量检测

由图5可知，在试验浓度范围内，一定浓度的RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞24、48、72 h后，细胞内的SOD含量均有提高，且在RJ为2 mg·mL-1时，细胞处理48 h与对照组相比差异显著，RJ处理72 h后，所有细胞中SOD含量均高于对照组.结果表明，一定含量的RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞一定时间，能提高细胞内SOD活性，增加细胞抗氧化能力.

2.6 细胞中MDA含量检测

由图6可知，在试验浓度范围内，一定浓度的RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞24、48、72 h后细胞内的MDA含量均有降低，与RJ含量呈负相关.处理24和72 h试验组和对照组相比，MDA含量均有显著或极显著差异；处理48 h，RJ含量为0.5、2和8 mg·mL-1时，试验组与对照组相比有显著差异.该结果表明，一定含量的RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞一定时间，能降低细胞中MDA含量，防止脂质过氧化造成的细胞损伤.

2.7 细胞中ROS含量的检测

由图7可知， RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞24、48、72 h后细胞内的ROS含量均有变化.8 mg·mL-1RJ处理24 h，与对照组相比ROS含量有所升高，有显著差异；低含量RJ处理48 h时，试验组与对照组相比ROS有所下降且差异显著，而高含量时ROS则有所上升且差异显著；低、高含量RJ处理72 h，试验组与对照组相比ROS有所下降且差异显著，而RJ含量为中间值时，ROS有所上升且差异显著.该结果表明，低含量RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞48 h，低、高含量RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞72 h可降低代谢过程中产生的一系列活性氧簇，降低细胞的氧化损伤.

3 讨论

导致AD的因素很多，年纪增长导致的身体机能衰退，患者脑内的局灶性炎症反应造成的损伤，氧化应激作用导致的神经细胞受损和凋亡，高血压高血脂对脑部血管的损害等都会引起相关的症状和病情.RJ作为一种适合中老年人食用的保健品，能提高中老年人的抵抗力和身体素质，具有抗炎、抗氧化、调节血脂和血压、降血糖的功效.因此，进一步研究RJ对AD的作用，对于RJ的功能开发和应用具有重要意义.

RJ对AD的作用时有报道.Zamani et al[10]用RJ饲喂侧脑注射了链脲佐菌素的AD模型小鼠，用迷宫试验测试大鼠的空间学习记忆能力，结果表明，与未饲喂RJ的模型小鼠相比，试验组的小鼠发病潜伏期增长，空间学习记忆能力有所提升，因此RJ在AD的神经保护作用中起着很重要的作用.Pan et al[11]研究表明，在饲喂2%胆固醇和铜饮用水构建的Aβ AD兔模型中，RJ干预后AD兔大脑SOD水平显著升高，MDA含量和ROS/RNS含量降低，表明RJ具有通过增强抗氧化能力来保护神经元的潜力.孙平[12]利用蜂王幼虫肠道酶酶解RJ水溶性蛋白制备出的蜂王浆多肽(RJP)，对β-淀粉样蛋白25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型的保护作用进行了研究，试验结果表明，分子质量为1～3 ku和3～5 ku的RJP可减少细胞内ROS的产生.现有研究中，关于RJ对tau蛋白磷酸化相关的神经保护作用鲜有报道.因此本研究选用SH-SY5Y细胞，利用OA对该细胞tau蛋白磷酸化的作用建立阿尔兹海默症神经纤维缠结的病理细胞模型，研究RJ对阿尔兹海默症抗氧化的作用.与动物试验相比，细胞试验更灵敏高效.由于体内环境非常复杂，活性物质很可能在发挥作用前就因为化合物自身稳定性差或被其他部位降解等原因失效，而细胞试验可以有效避免此类问题，更便于研究RJ的直接作用和对RJ中有效成分的探索.

适应是细胞对于内、外环境中有害因子的刺激作用产生的非损伤性应答反应，是介于正常与损伤之间的一种状态，若刺激超过了细胞的耐受与适应能力，便会造成损伤.适应在形态学上的一般表现为肥大、增生和化生，涉及细胞数目、细胞体积或细胞分化的改变[13].相关试验证明，化学毒物能够诱导细胞产生适应性反应[14-16].由此推测，OA诱导损伤SH-SY5Y细胞建立阿尔兹海默症细胞模型，需要一定的剂量和处理时间，OA用量较低或处理时间不足，细胞会产生适应性反应造成增生，形成短时间细胞活度的增加以抵御环境变化造成的损伤，增加在不利条件下的生存能力，因此，需要增大剂量或者延长处理时间，使细胞达到应有的损伤效果.本试验中，如图1，CCK法检测不同浓度的OA诱导损伤SH-SY5Y细胞12 h后的细胞活度比对照组高，因此考虑提高OA损伤时间以达到损伤效果.延长损伤时间至24 h时即产生了较好的损伤效果.

研究表明，氧化应激在多种神经退行性疾病的病变过程中起着重要影响[17].作为酶抗氧化系统中重要成员的SOD，其分布广泛，是生物抗氧化系统中的重要成分，能清除生物体内有害物质，尤其是减少氧自由基对生物体造成的损害[18].SOD酶含量检测中，只有2 mg·mL-1RJ对细胞处理48 h时与对照组相比差异显著，虽然其他含量的RJ处理OA诱导损伤的SH-SY5Y细胞24、48 h后，细胞内的SOD含量也有提高，72 h后所有处理均高于对照组，但未达到差异显著，这可能是细胞经过损伤后状态较差以及培养时间过长造成细胞凋亡等原因使其新陈代谢下降，造成了酶诱导生成下降.

MDA是脂质氧化的终产物，是氧化应激反应的敏感指标，其可反应自由基的活动状态以及机体受影响程度[19].本研究中，MDA含量与RJ含量呈负相关，随着RJ含量的升高而降低，说明RJ对脂质的抗氧化能力尤其膜脂的保护作用很强.MDA还会造成蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合而导致细胞毒性[20]，因此RJ可能通过降低MDA，减少蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合而发挥其细胞保护作用.

ROSs包括超氧阴离子、羟基自由基、脂质过氧化氢及其副产物，在神经退行性疾病中具有双重作用，低浓度的ROS可促进细胞的增殖和分化，中、高浓度的ROS会通过氧化应激反应造成细胞损伤甚至诱导细胞凋亡或坏死[21].根据试验结果推测，RJ对ROS的影响可能是一个长效调控的过程，发挥作用需要一定时间.研究中，只有8 mg·mL-1RJ处理24 h与对照组相比ROS有所升高且差异显著，其他含量与对照组相比无显著差异.在48 h之后，低含量的RJ会使ROS含量下降，更有益于细胞的生长.72 h时，低含量和高含量的RJ作用细胞与对照组相比都有所降低并差异显著，但高含量的RJ可能由于渗透压较高会对细胞造成损伤而使细胞状态较差，造成生成的ROS较低，所以推测低浓度的RJ在活性氧方面对细胞的抗氧化作用更好.

综上，RJ对阿尔兹海默症SH-SY5Y细胞模型具有很好的抗氧化作用，RJ的影响效果与前人试验结果一致，因此推测其对受损神经细胞有一定保护作用，可能对AD有一定积极的效果.