橄榄苦苷对染砷小鼠大脑神经免疫相关基因表达的影响*

王 昱

(陇南师范高等专科学校农林技术学院，陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 成县 742500)

0 引 言

我国饮水型砷中毒分布广、影响人群多，是环境砷中毒的主要类型[1]．砷通过食物链或饮用水进入人体，容易蓄积，潜伏期长，危害大．研究显示，慢性饮水型高砷暴露使动物的空间学习、记忆能力下降[2]，损伤神经元或增加神经系统损伤易感性[3]，诱导凋亡人胶质瘤细胞[4]，干扰动物大脑组织白细胞介素(IL，interleukin)家族部分基因和下丘脑-垂体-肾上腺轴受体相关基因的表达[5]，抑制机体的细胞免疫、体液免疫、巨噬细胞及淋巴细胞系统整体功能[6-7]．橄榄苦苷(OP，oleuropein)属于天然的多酚化合物，是油橄榄中最主要的含量最多的活性成分[8]．本课题组前期已经研究了OP在降血糖、抗衰老及降血脂等方面的药理作用[9-11]．为了进一步研究OP的药理作用，本研究在三氧化二砷(As2O3)染毒小鼠的基础上给予OP干预，观察大脑组织部分神经免疫相关基因表达的变化，探讨其拮抗神经毒性的保护作用．

1 材料与方法

1.1 动物模型建立与给药

健康昆明小鼠30只(购于兰州大学实验动物中心，生产许可证编号：14-006，体质量 18～20 g，雌雄各半)，同条件饲养1周后随机分为3组(每组10只)：As2O3组、As2O3+OP组和对照组．As2O3组每天灌胃4 mg/kg剂量的As2O3溶液[12]；OP组灌胃4 mg/kg剂量的As2O3溶液，同时灌胃100 mg/kg的OP[10](陇南田园油橄榄科技开发有限公司提供)；对照组每天灌胃等量的0.9% 生理盐水．3组实验连续处理5周后，断头处死小鼠，立即取大脑储存于RNA保存液中，备用．

1.2 总RNA 的提取和基因芯片杂交

分别研磨各组实验小鼠大脑，按照TRIzol 试剂盒(美国Invitrogen 公司)操作说明从中抽提总RNA，用RNeasy Mini Kit(美国Oiagen公司)进行纯化．用UV-1800紫外分光光度仪(日本Tokyo)测定RNA 的浓度和纯度，变性胶电泳(美国Sigma公司DEPC水和溴酚蓝，Bocherigmer公司MOPs缓冲液)检测RNA 有无降解，然后反转录成cDNA、体外转录合成cRNA 探针，同时用生物素标记探针，片段化处理探针，45℃下在杂交箱640 (美国Affymetrix 公司)中与Mouse Genome 4302.0 Araay 基因芯片杂交16 h，全自动芯片洗涤工作站450(美国Affymetrix 公司)中洗脱、染色；最后用GeneArrayTM扫描仪3000(美国Affymetrix 公司)扫描杂交信号．

1.3 芯片数据处理和生物学信息分析

采用Microarray Suite Version 5.0软件(美国Affymetrix 公司)进行分析，在对单个样本表达分析的前提下，建立对照组、As2O3组、As2O3+OP组基因表达谱，其中P>0.06 为不表达，P<0.04为表达，P值在0.04～0.06 为临界值．将各组实验的基因表达谱进行组间比较，根据信号强度比值的对数(signal log ratio，SLR)判断．SLR>1(即表达倍数>2)为表达上调，SLR<-1(即表达倍数<2)为表达下调，建立各组差异表达的数据库．

2 结 果

2.1 IL家族基因的表达

OP对小鼠大脑IL家族基因表达的影响结果列于表1．与对照组相比，As2O3组小鼠大脑组织基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-1f6、IL-13、IL-25和IL-24表达均下调，IL-17d表达上调．与As2O3组比较，As2O3+OP组小鼠大脑组织基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-25和IL-24表达下调，IL-1f6和IL-17d表达上调，IL-13表达无差异．除了基因IL-15、IL-24外，其他基因在对照组与As2O3+OP组小鼠大脑组织的表达无差异．不同组间IL家族基因差异表达倍数结果显示，OP干预后，基因表达变化幅度减小，说明OP干预有效.

表1 不同组间小鼠大脑白细胞介素家族基因差异表达倍数

注：OP为橄榄苦苷；As2O3为三氧化二砷；IL为白细胞介素.

2.2 IL家族受体基因的表达

OP对小鼠大脑IL家族受体基因表达谱数据列于表2．与对照组比较，As2O3组小鼠大脑组织基因IL-13受体α1(IL-13ral)和IL-2受体 γ 链(IL-2rg)表达上调，IL-17受体C (IL-17rc)表达下调．与As2O3组比较，As2O3+OP组小鼠大脑组织基因IL-13ral、IL-12rg和IL-17rc表达上调．基因IL-13ral、IL-2rg和IL-17rc在对照组与As2O3+OP组小鼠大脑组织的表达无差异．As2O3+OP组与As2O3组的基因差异表达倍数均小于As2O3组与对照组的表达倍数绝对值，说明OP干预有效.

2.3 丘脑-垂体-肾上腺轴相关基因表达

OP对小鼠大脑下丘脑-垂体-肾上腺轴相关基因表达结果列于表3．与对照组比较，As2O3组小鼠大脑组织基因促肾上腺皮质激素释放激素受体1(Crhr1)、促肾上腺皮质激素释放激素受体2(Crhr2)、精氨酸加压素(Avp)、精氨酸加压素受体1B(Avpr1b)、精氨酸加压素受体1A(Avpr1a)、精氨酸加压素受体2(Avpr2)表达下调，促肾上腺皮质激素释放激素(Crh)和阿黑皮素原α(Pomc1)表达上调．与As2O3组比较，As2O3+OP组小鼠大脑组织基因Crhr1、Crhr2、Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2表达下调，Crh和Pomc1表达上调．除了基因Crhr2外，其他基因在对照组与As2O3+OP组小鼠大脑组织的表达无差异．同上，组间基因差异表达倍数绝对值变小，说明OP干预有效.

表2 不同组间小鼠大脑白细胞介素家族受体基因差异表达倍数

注：IL-13ral为IL-13受体α1；IL-2rg为IL-2受体 γ 链；IL-17rc为IL-17受体C.

表3 不同组间小鼠大脑下丘脑-垂体-肾上腺轴相关基因差异表达倍数

注：Crh为促肾上腺皮质激素释放激素；Crhr1为促肾上腺皮质激素释放激素受体1；Crhr2为促肾上腺皮质激素释放激素受体2；Avp为精氨酸加压素；Avpr1b为精氨酸加压素受体1B；Avpr1a为精氨酸加压素受体1A；Avpr2为精氨酸加压素受体2；Pomc1为阿黑皮素原α.

3 讨 论

砷可通过血液和脑脊液进入脑实质而损伤脑组织，导致脑功能失调[5]．中枢神经系统释放的IL可作用于神经内分泌系统，影响免疫系统特定的功能，而且还可能参与神经系统、内分泌系统及免疫系统间的相互调节．本实验利用基因芯片技术分析结果显示，As2O3组小鼠大脑IL家族基因及受体基因IL-3、IL-10、IL-11、IL-1a、IL-15、IL-20、IL-23a、IL-31、IL-1f6、IL-13、IL-25、IL-24和IL-17rc表达水平显著低于对照组，IL-17d、IL-13ral和IL-2rg表达水平显著高于对照组，说明上述IL家族部分基因表达水平的变化，可能与砷的免疫毒性作用有关，这与王艳艳等[5]的研究结果一致．经OP干预后，染砷小鼠大脑组织IL家族部分基因的表达水平与对照组表达无差异，提示通过调节大脑IL家族基因的表达是减轻砷致免疫毒性的途径之一．

下丘脑-垂体-肾上腺轴是神经内分泌系统的重要组成部分，已有研究表明，大脑组织Crh的相关基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1和Crhr2等是调控肾上腺皮质激素分泌的重要基因[5]，这些基因下调会导致促肾上腺皮质激素的分泌减少，引起肾上腺皮质萎缩，分泌功能减退，进而抑制免疫功能．本研究显示，染砷小鼠大脑组织下丘脑-垂体-肾上腺轴受体相关基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1、Crhr2表达水平均低于对照组，这进一步表明砷可能影响神经免疫调控功能的重要生物信息．经OP干预后，染砷小鼠大脑组织下丘脑-垂体-肾上腺轴受体相关基因Avp、Avpr1b、Avpr1a、Avpr2、Crhr1、Crhr2的表达变化幅度均变小，这表明OP影响了小鼠大脑组织内下丘脑-垂体-肾上腺轴受体相关基因的表达，但还需进一步探讨．