基于LAMP的微流控芯片病原体快速检测方法研究进展

2020-01-09贾舒麟刘怡辰赵佳琪

中国实验诊断学 2020年4期

赵阳，王喆，贾舒麟，刘怡辰，赵佳琪，赵臣*

(1.中国人民解放军联勤保障部队第965医院传染科，吉林吉林132012；2.吉林医药学院检验学院；3.北华大学医学技术学院)

急性传染病具有传播速度快、传播范围广、不易控制等特点，严重威胁着广大人民群众的生命安全，其快速检测、早期诊断尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)是新型的基因扩增技术，可在恒温环境下快速、灵敏、高效、特异地进行基因扩增，具有特异性强、灵敏度高、检测耗时短、操作简便等优点。目前，LAMP技术与微小可控、功能集成的微流控芯片技术相结合，发展出一种快速、准确的，适用于即时检测的新型基因分析技术。它简化了基因检测过程中繁琐的样品处理和扩增产物的检测步骤，适用于在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂进行的现场快速检测(POCT)[1]，被广泛应用于医疗[2]、农牧业[3]、检验检疫[4]和刑事侦查[5]等领域中。本文就基于LAMP的微流控芯片快速检测技术在传染病病原体检测中的应用研究作一综述。

1 环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP是由日本学者Notomi等[6]提出的一种新型等温基因扩增方法。该技术对基因的扩增分为两个阶段。第一阶段为启动阶段，是茎环形成的阶段。双链DNA模板在等温(60-65℃)的条件下通过一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)并依赖于4-6条特异性引物产生一条两端成环的单链DNA，形成茎环状结构[7]，该结构是第二阶段基因扩增的起始结构。第二阶段是循环扩增阶段，以茎环结构为模板，进行DNA合成延伸以及链置换，最后产物为含有若干倍茎长度的茎环DNA混合物[8]。扩增过程中产生的焦磷酸与Mg2+反应产生焦磷酸镁沉淀[9]，可作为扩增结果的观察依据。

1.1 LAMP技术高特异性、高灵敏性LAMP技术使用1对外部引物和1对内部引物等2对特异性引物，可以识别目的基因序列上6个不同的区域，对目的基因序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响，因此扩增的特异性非常高。Aryan等[10]选择重复插入IS6110序列建立了LAMP检测MTB复合群方法，灵敏度比通常的PCR方法提高了20倍。LAMP对目的基因序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响，具有非常高的特异性。

1.2 LAMP技术步骤简单、效率高、成本低LAMP技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR 技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，具有显著的高效性，可以在60 min内把拷贝的目的基因迅速扩增到109拷贝[6]。相较于PCR复杂的升降温技术和依赖核酸序列扩增技术[11]繁多的扩增步骤和反应体系，LAMP无需进行模板预变即可实现等温扩增，免去了对昂贵、精密实验仪器的要求，而且更易于搭载微流控芯片。

1.3 LAMP扩增结果观察便捷、精确LAMP阳性扩增反应中会产生大量白色焦磷酸镁沉淀，可利用浊度仪、凝胶电泳、直接肉眼观察或根据颜色变化进行检测，扩增反应结束即可直接肉眼观察反应结果，或根据试剂颜色变化判断是否发生反应。此外，病原体检测只需对样本进行简单处理，省略了繁琐的基因提取步骤，更适用于病原体POCT快速检测。

2 微流控芯片技术

20世纪90年代初，A.Manz等[12]首次提出了微流控芯片的概念，是将生命科学应用分析的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元，集成到一块微米尺度芯片上的微型化整合技术，实现操作、检测一体化，只需微量的样品与检测试剂，即可实现几分钟甚至更短时间内上百个样品的平行自动分析[13,14]。随着微流控芯片技术的不断发展，目前已经诞生了数字微流控芯片、蝶式微流控芯片、卡式微流控芯片、电泳分析微流控芯片、HDA微流控芯片、POC微流控芯片等多种微流控芯片[15-17]。

微流控芯片技术具有液体流动可控性、低成本、耗样量少、高效检测的高度集成微型化等特点，还可避免因传统方法功能局限而带来的损失与污染。早在2010年，Cheng等[18,19]首次利用纸基微流控芯片检测人类免疫缺陷病毒和T7噬菌体，结果表明该技术比传统ELISA法和PCR法更快、更经济。

3 基于LAMP的微流控芯片在急性传染病病原体快速检测中的应用

急性传染病病原体检测关系到疾病的流行病学分析和早期防控等多方面问题。目前的病原体检查方法已经从传统的免疫学方法过渡到了分子生物学方法，基于LAMP的微流控芯片技术准确度高、操作简单、反应快速、反应结果易于观察，尤其适用于突发疫情的POCT监测，在急性传染病的防控中可以发挥十分重要的作用。

3.1 在甲型H1N1流感病毒检测中的应用张永乐等[20]利用LAMP技术成功检测甲型H1N1流感病毒，在将H1N1质粒进行10倍稀释后LAMP法仍能检出，灵敏度、特异性良好。孔文[21]等现场采集70份鼻咽拭子标本，整合环介导等温扩增技术和微流控芯片技术，建立了微流控实时荧光逆转录环介导等温扩增快速检测甲型H1N1流感病毒方法，能在恒定温度(65℃)30 min内完成扩增反应，检测限度可达10 copies/μL。经对多种流感病毒基因提取物进行检测，结果仅甲型 H1N1流感病毒产生扩增曲线，且将待测物模板梯度稀释后发现，反应灵敏度可达10 copies/μL，表明该方法可高特异性、高灵敏度地检测H1N1流感病毒。王瑞丽[22]建立的微流控LAMP方法并成功应用于甲型H1N1流感等流感病毒的检测，其检测限为10-100 fg/反应，整个反应过程在30 min内完成，提高了对流感疫情的监测能力，为患者就医争取了宝贵的时间。

3.2 在人类免疫缺陷病毒(HIV)检测中的应用郭宏雄[23]等成功建立HIV的LAMP检测方法，灵敏度检测结果显示该方法可检测出10 copies/μL的病毒样品；特异性检测显示在多种病毒模板中只能扩增HIV-1样品，不会出现假阳性；临床样品检测结果显示该方法检测阳性符合率可达84.3%以上，对主要流行HIV亚型均有较好的检测效果。蒋兴宇等[24]利用一种新型的微流控免疫检测方法成功提高了HIV的检测效率，实现了P24、P41、P120等抗原与多个血清样品的免疫反应的同时检测，将至少4个小时的检测缩短至10分钟内，且结果与传统ELISA法符合率100%。Chen等[25]将LAMP与微流控芯片技术结合，成功实现HIV RNA的CARD芯片提取和RT-LAMP检测，检测过程大约20 min即可完成，分析灵敏度在每毫升103病毒颗粒(103vp/mL)范围内，卡式微流控环介导等温扩增技术可成功实现HIV检测。

3.3 在乙型肝炎病毒(HBV)检测中的应用邵靓婧等[26]成功利用LAMP技术进行乙型肝炎的快速检测，采用羟基萘酚蓝作为显色剂建立HBV的可视化 LAMP 反应体系，在1 h内敏感、特异地检测出血清中的HBV，检测低限为10 copies/μL。王可可[27]等成功利用微流控荧光定量PCR技术实现HBV的快速检测，扩增结果通过实时计算确定其Ct值在37左右，检测结果呈HBV弱阳性，成功检测出血液样本中的微量HBV。郅晓[28]将LAMP技术集成在微流控芯片中，成功实现HBV基因分型检测，在63℃的恒温反应1 h，然后进行琼脂糖凝胶电泳。当微流控芯片微通道中发生 LAMP反应的时候，微流控芯片上标记有探针的同一区域会在注入磁性纳米团簇之前和之后分别被GMR传感器电阻检出，电阻变化值显示阴、阳性信号明显。检测系统的灵敏度高达10 copies/mL，检测范围为10-109copies/mL。

3.4 在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测中的应用2015年管潇[29]等已成功运用一种基于LAMP的集细菌在线裂解、核酸提取、目标基因扩增和产物检测一体化的集成式微流控芯片实现对MRSA的在线检测。以MRSA的mecA基因为靶基因，完成101-106cfu的在线裂解、LAMP扩增和产物测定。1 h内即可实现对MRSA mecA基因的快速检测，反应后将该将芯片置于自然光下，观察LAMP反应腔颜色，阴性对照显示为橙色不变，阳性对照和106cfu/μL样本显示为绿色。此外，Huang[30]等设计的蝶式空气绝缘微流控LAMP芯片可以检测低至10 copies/μL，经229例肺炎支原体、MRSA和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的病人痰标本双盲实验，显示该检测系统与传统RT-PCR的符合率可达99.56%。

3.5 在脑膜炎奈瑟球菌检测中的应用李海清等[31]成功利用LAMP技术实现对脑膜炎奈瑟球菌的快速检测，灵敏度实验显示LAMP扩增最低可达10fg，是PCR扩增体系最低检测限度的10倍。Dou等[32]将自主研发的微流控LAMP PDMS/纸混合技术成功实现对脑膜炎奈瑟球菌的检测，可同时检测三种待检样品，检测灵敏度高，最低检出限为3个拷贝，是目前有报道的将LAMP检测系统用于病原体检测的最低检出限。该装置使用色谱纸作为底物，反应产物可与底物结合发生颜色变化，灵敏度高，适合基层医疗机构POCT实时床旁诊断。

3.6 在结核分枝杆菌检测中的应用刘毅等[33]成功利用LAMP技术检测肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌，检出限为120 cfu/mL，检测特异性、敏感性均为100%。陶峰等[34]联合LAMP技术与结核分枝杆菌快速培养实现对涂阴肺结核诊断，较传统涂阴肺结核阳性检出率40%相比，LAMP检测敏感性为81.3%，特异性78.6%，均高于传统方法诊断，对于肺结核杆菌的诊断与防治具有重要意义。方雪恩[35]结合LAMP和微流控技术建立单重、多重微流控集成芯片，可用于床边细菌性病原体一次性快速诊断。该技术整合了基因提取、扩增和信号检测技术，仅需约10 μl的原始样品，就可以在45-60 min内直接通过肉眼快速判定被检样品中是否含有肺结核杆菌。