常染色体隐性多囊肾的研究进展

刘洋 梁磊 赵建荣

囊肿性肾病(cystic fibrosis disease)是指肾脏出现单个或多个囊肿的一大组疾病，其中单纯性肾囊肿最常见，其次是多囊肾病(polycystic kidney disease,PKD)。囊肿性肾病根据遗传与否，分为遗传性和非遗传性两大类；前者包括常染色体显性、隐性和X-连锁遗传三种[1]。常染色体隐性遗传多囊肾病(ARPKD)是以肾小管囊肿(集合管系统为主)形成为特征，最终导致终末期肾病[2]。ARPKD是一种罕见的遗传性疾病，其发病率为1∶40 000～1∶20 000，主要为胎儿和婴儿，是围产期死亡的常见原因之一[3]。新生儿时期，死亡风险相对较高，许多婴儿因呼吸衰竭而死亡。随着孩子年龄的增长，会出现进行性肾脏病，肝脏纤维化及继发性门脉高压[4]。ARPKD是导致儿童透析依赖和儿童肾、肝或肝肾联合移植(KTx,LTx,CLKTx)的主要原因之一[5]。研究表明ARPKD是由多囊肾肝疾病1(PKHD1)基因或DAZ相互作用蛋白1样基因(DZIP1L)突变引起[6,7]。罕见病的概念在我国出现的时间并不长，因其特殊和罕见，临床医生也常因认识不足而出现误诊或漏诊。虽然从单种疾病来看，每个罕见病的发病率都较低，但由于疾病种类众多,目前患患者数不断增长。虽然我国临床对于遗传性肾脏疾病的诊断提高到分子遗传学水平，提前到产前诊断阶段，但仍面临众多问题。本文主要围绕ARPKD突变基因及相关基因测序进行综述，希望对临床工作有所帮助。

1 发病机制

1.1 PKHD1 ARPKD主要由PKHD1的突变引起。2002年两个独立的研究组分别采用不同的方法定位克隆了ARPKD的致病基因；并命名为PKHD1基因；PKHD1是一个大而复杂的基因，具有复杂的转录谱，可能产生多种蛋白亚型。其位于6p12染色体上，包含470 kb以上的基因组序列。其最长的阅读框(ORF)由66个外显子组成，可偏码一个大的单通道跨膜蛋白-纤维素蛋白(fibrocystin)。尽管fibrocystin在ARPKD表型形成中的确切作用尚未清楚，但其在初级纤毛的定位及其与阳离子通道polycystin-2的相互作用表明其参与信号传导，这一通路的破坏会引起相应器官中管状结构形态及稳定性的缺陷。纤毛是一种以微管为基础的细胞器，从大多数脊椎动物细胞的表面伸出，起着化学、机械感觉和液体运输的作用。此外，一些证据显示，fibrocystin与钙离子(Ca2+)调节的亲环配体的相互作用提示其可能也参与了Ca2+稳态的调节[8]。它主要表达于肾脏(多集中在肾小管和肾小管增厚环)、肝脏(胆管上皮)和胰腺[9,10]。囊性肾病是一些综合征性纤毛病的特征之一，起因是原发性纤毛功能障碍[11]。此外，ARPKD所致的胆管上皮细胞原纤毛的缺陷在肝脏中也能够诱发胆管板畸形，进而影响胆管的正常发育，最终导致胆道系统的囊性病变、炎性病变和纤维化[12]。多种基于PKHD1的ARPKD模型已被描述，主要是通过基因靶向方法在小鼠中产生的。虽然在所有这些小鼠模型中都存在ARPKD的肝脏表型，但肾脏表型通常不存在，而且出现时是一种轻度、缓慢进展的病变，多累及近端小管而非集合管。一些模型也有严重的胰腺导管表型，而在ARPKD患者中，具有临床意义的胰腺疾病相当罕见。这些动物模型中轻度肾表型的机制尚不清楚。然而，由于遗传背景似乎对肾脏病理学有重要影响，遗传修饰物可能调节肾脏疾病。PCK大鼠由于PKHD1的自发突变而产生，其肝脏表型与ARPKD非常相似，而该模型中缓慢进展的肾囊性病变与ADPKD的肾囊性病变相比，更接近ARPKD。将PCK大鼠的PKHD1突变导入到不同的背景中，可以改善肾脏的表型，但不能改善肝脏的表型，这再次表明遗传因素调节了肾囊性表型的严重程度。有研究共检测到128个基因突变;55.5%的突变是截断型的，包括分帧、小缺失、插入、重复、无义和带外显子跳跃的剪接突变，42.2%是错义突变[12]。目前许多不同的PKHD1已经在整个基因组中被报道，这些突变的组合决定了ARPKD患者的表型，且表型的严重程度可能取决于沿着纤维胞浆蛋白的氨基酸取代的位置。到目前为止，在ARPKD/PKHD1 Aachen数据库中已经描述了748个PKHD1基因变体[13],如此高数量的新变异导致了基因型与表型的相关性问题。由于复合杂合子多个等位基因的高发生率，建立PKHD1的基因型-表型相关性具有很大难度，因此目前基因型-表型相关性关注的是突变类型，而不是突变的特定位点。且两个截断突变的患者具有致命的表型，并表现出围生儿或新生儿死亡率；而至少一个错义基因存在的患者受影响较小，更有可能在新生儿期存活，这表明许多错义突变是产生部分功能蛋白的半等位基因[14-16]。完整的纤维囊蛋白的临界量似乎是正常功能所必需的，但显然不能被替代的亚型所补偿，这可能是由下游的ATG密码子重新启动翻译所产生的。相反，错义突变和小的框内缺失可能对蛋白质功能有更多的可变影响[17]。表型的多样性还反映了不同的PKHD1错义突变可能在多大程度上损害突变蛋白的功能和(或)丰度。Burhan等[18]在沙特患者的外显子和侧翼区域研究中，证实了ARPKD(PKHD1)基因中，由于氨基酸取代而导致的致病变异。

1.2 DZIP1L 最近在中度ARPKD的临床过程中， DZIP1L的突变已被报道。Lu等[7]在来自4个家庭的7例患者中发现了纤毛相关基因 DZIP1L的纯合突变。在两个不相干的同源多血统中，通过连锁分析和测序排除已知的PKD基因突变，共发现5例儿童患ARPKD。并通过分析父母及所有受影响儿童的DNA中进行全基因组的SNP，发现了一个重叠的纯合峰，这表明在染色体3p22上存在区域为7.5 Mb的新的疾病位点。DZIP1L编码睫状体蛋白(DAZ相互作用蛋白1)，与其他PKD蛋白共同定位于中心粒以及基体远端。DZIP1L基因包含基因组中53个碱基对，包含16个外显子，编码767个氨基酸的蛋白质。与PKHD1相比，DZIP1L突变引起的ARPKD相对较罕见，可能与PKHD1相对于DZIP1L更大有关。此外，有数据表明，DPIP1L n端区域的基因更容易突变[19]。初级纤毛是Hedgehog基因(Hh)信号传导所必需的微管状细胞器，由一个基底体、一个纤毛轴突和一个位于前两个结构之间的腔室组成，称为过渡区(TZ)。TZ是控制纤毛蛋白组成的“看门人”，但其在纤毛芽形成中的作用尚不清楚。Wang等[20]证实了Hh信号通路需要 DZIP1L，其与基础体附属物蛋白和Rpgrip1l(TZ蛋白)共同定位。Dzip1l的缺失会导致体内纤毛形成减少和畸形纤毛。相关实验模型中观察到在表型变异ARPKD中,Dzip11小鼠(由N-ethyl-N-nitrosourea-induced诱变筛选识别且包含一个无义突变Dzip1l)显示许多胚胎形态缺陷,包括肢体和颅面缺陷等。通过将Dzip1lwpy/wpy小鼠与一个外系杂交，改善了颅面表型，这表明至少在人类ARPKD表型上的一些差异可能是由于遗传背景影响所致。在Dzip1l胚胎中检测到与Hedgehog信号传导相关的基因表达的组织特异性变化，如肢体的基因表达变化与polydactyly一致[7]。总之，这些数据提供了ARPKD不是一种同质性疾病的结论性证据，并证实DZIP1L是其发病机制中的第二个基因。

2 基因咨询

ARPKD基因变异位点可散在分布于整个 PKHDl基因片段上，由于检测手段和研究人群的不同， PKHDl基因变异的检出率为42%～87%[21]。大多数家庭都有自己的突变，因此在ARPKD患者中由于私人突变而观察到可变表型，基于基因的诊断仍然很困难。但是，检测出更多与疾病分离的突变将改进基于基因的诊断。目前靶向外显子组测序已成功用于识别导致孟德尔疾病的基因[22]。分子遗传学检测方法包括单基因检测、多基因面板、外显子测序和基因组测序[23]。

单基因检测：首先对基因进行序列分析；如果只发现一个或未发现致病变异，则进行基因定位的删除、重复分析；多基因面板：许多遗传疾病和表型是异质的,即>1个基因的致病变异可以导致1个表现型或1个遗传疾病。在下一代测序发展之前，检测1个以上基因唯一经济有效的方法是序列单基因检测(即测序)，这种方法昂贵且耗时；随着多基因板的发展及广泛应用，可以同时检测2～150个基因。多基因面板中使用的方法可能包括序列分析、删除/重复分析、其他非基于序列的测试[24]。

更全面的基因检测包括外显子测序和基因组测序。外显子测序旨在分析基因组中编码蛋白质的核基因序列。基因组测序旨在识别所有编码和非编码的细胞核DNA序列。虽然基因组测定可以识别编码区外的突变，但通常无法确认这些变异的致病性[24]。目前,PKHD1 基因的突变检测存在 3 个限制因素:基因很大、存在很多的突变杂合子以及存在不同的转录本。PKHD1 的突变散布于整个基因。在突变谱方面,大约 45%的是使多肽链提前终止的无义突变。突变的类型比突变的位点更能反应预后,无义突变比错义突变预后差,凡一对等位基因都携带无义突变的患儿均在围产期或新生儿期死亡。发病率低和突变基因的不同组合使研究 ARPKD 的基因型和表型联系比较困难,还需要更多的病例和更好的检测方法进行系统的分析。有文献报道，应用PCR扩增、DNA直接测序等技术手段对引产胎儿PKHD1基因进行测序，结果发现，该引产胎儿第17号外显子c．1587T>C(p.N529N)变异与第32号外显子c.3785C>T(p.A1262V)变异[25]。这两种变异在国外一些研究中被认为是多态性位点(polymorphism，SNP)，但仍具有可疑致病性。且17号外显子发生同义突变，其编码蛋白质未发生改变；而32号外显子发生错义突变，从而使纤囊素蛋白多肽链的第1 262号氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，不排除这种突变引起纤囊素蛋白功能改变，但缺乏来自表达谱的直接证据，因此本课题组认为由于剪接异常导致蛋白功能缺陷，最终导致疾病的比例可能比已知更高，传统的外显子组测序/基因组测序等DNA检测在这一类变异的检测中可能会有大量的漏检，尤其是对于编码区和内含子区域的变异来说。外显子捕获测序可以得到序列变异的信息，而转录组测序不仅可以获得已知序列的变异信息和新的转录本信息(针对从头拼接)，还可以得到表达谱信息。除此以外，转录组测序还能够分析mRNA的可变剪接，而外显子捕获测序的样品来源是基因组，不能进行mRNA的可变剪接分析，只能得到外显子上的序列变化。虽然已经报道过有关 PKHD1 的多个可选剪接的转录，然而这些亚型的确切功能和临床意义尚不清楚，有待于进一步研究。

为了提高ARPKD的总体诊断率，使ARPKD尽快进入下一批罕见病目录，本课题组考虑到全转录组测序可进行全基因组水平的基因表达差异研究，具有定量更准确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点，除了分析基因表达水平，全转录组测序还能发现新的转录本、SNP、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达，计划在外显子组测序的基础上进行全转录组测序，希望通过全转录组测序提高常染色体隐性遗传多囊性肾脏疾病的整体诊断率，并希望通过与数据库中的表达谱进行结果比对分析，进一步鉴定出新的致病变异，利用分析框架集中发掘患者独特的转录水平变化。Daniel MacArthur领导的团队第一个利用全转录组测序(RNA-seq)进行孟德尔遗传疾病的基因诊断队列研究。研究团队对那些未确诊的罕见遗传病患者的骨骼肌活检样本进行RNA-seq，以探索使用DNA-seq不易鉴定出的新型致病突变，例如致病性剪接位点变异。这项研究是迄今为止最大的一项针对未确诊疾病患者进行转录组测序以确定遗传疾病相关未知突变的研究。研究结果表明RNA-seq能够帮助鉴定许多DNA-seq中未能鉴定的剪接变异，首次证明了遗传疾病中RNA-seq在临床诊断中也具有重要的意义。有研究发表了RNA测序应用的最新研究成果，RNA测序数据有助于发现罕见的基因变异，同时，研究团队开发了一种新的方法-表达变异分析(ANEVA)，能够通过分析两个等位基因的表达失衡来诊断罕见疾病。且该研究团队展示了将新方法应用于70位孟德尔肌肉疾病患者的RNA-seq数据，不仅帮助确定了病例中确切的致病基因变异，并确诊了数个潜在的新病例[26]。可见，RNA-Seq 正在革命性的影响转录组研究，这是一种高度灵敏而准确地在转录组层面衡量表达的工具，它可以在不同的疾病状态下、不同疗法的响应下、不同的环境条件下以及范围更广泛的其他研究中对以前未检测到的变化提供一种可见性。RNA-Seq 允许研究人员在一次实验中同时检测已知和新发的信息，包括转录本亚型、基因融合、单核苷酸变异、等位基因特异性基因表达以及目前通过先验知识尚不能明确的其他功能信息。

3 临床表现

ARPKD通常又被称为婴儿性多囊肾病，属于肝肾纤维囊性疾病； 以隐性遗传方式遗传，杂合子携带率为1∶70[20]。其发病时间不定，可以出现在围生期、新生儿期、婴儿期、青少年甚至成年期，男女发病率相等，不同种族间无明显差异。50%的患病胎儿因羊水过少导致肺发育不全而在围产期死亡，此期主要为肾损害。大多数患有ARPKD的个体在新生儿期出现临床表现，可表现为肾脏体积增大、高血压和不同程度的肾功能障碍；婴儿和儿童期高血压多见，常伴有心肌肥大、充血性心力衰竭；渡过婴儿期的患者预后相对较好[27,28]。APPKD肾衰竭进展相对缓慢，15岁之前20%～45%进展至终末期肾衰竭，25岁以前比列达70%；患儿常伴有生长缓慢、贫血及肾性贫血；随着年龄增长，肝脏症状及体征显现明显，包括肝纤维化、肝内胆管扩张以及引起的门静脉高压，可有胃肠道出血、门静脉血栓、脾大等，但肝功受累较罕见[29]。囊肿的发生和发展需要上皮细胞的增殖、上皮液的分泌和细胞外基质的重建。ARPKD 中器官受累程度的变化尚未得到合理的解释，但被普遍认可。在两种主要的囊性肾病中，ARPKD通常在围产期被诊断，而常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)被称为成人型多囊肾病。ADPKD也是一种多系统进行性囊性疾病，器官(如肝脏、精囊、胰腺、蛛网膜)有囊肿及非囊性病变(如颅内动脉瘤、水肿、主动脉根部扩张、胸主动脉剥离、二尖瓣脱垂、结肠憩室、腹壁疝)。ADPKD患者临床表现通常在30岁左右出现，常见高血压，伴有或不伴有肾源性疼痛或血尿或其他囊肿相关的并发症，如感染或破裂。其中，肾结石是一种已知的ADPKD并发症，它的发病率很高。肾小管性酸中毒等医学肾病在这一人群中也很常见。大约45%的患者可能发展为终末期肾病，这将导致他们依赖血液透析或肾移植。ARPKD与ADPKD形成囊肿的某些大体特征不同，以此进行鉴别。在胎儿宫内生活的前3个月，ARPKD囊肿起源于近端小管，但出生时它们仅局限于集合管，与肾元保持连续性。相反，ADPKD囊肿可能起源于肾元的任何部分，尽管来自远端肾元和集合管的囊肿通常占优势。ARPKD 通常在子宫内或出生时被诊断出来，并且表型差异很大，新生儿在年龄和初始临床症状表现方面存在显著差异，包括肾脏和胆管异常的相对水平。此外先天性肝纤维化(CHF)是ARPKD中一个不变的发现，而在ADPKD中很少观察到。在许多其他疾病中，病理表现中都有肾囊肿是，而这些与ARPKD的不同之处在于，肾囊肿仅代表该综合征的多种发育异常的一个组成部分。

4 治疗

ARPKD治疗取决于临床表现的严重程度和涉及器官：包括呼吸功能监测、肾功能检查、肝功能检查、婴儿生长评估、血压监测和对症治疗。双器官移植(肝和肾)取决于门脉高压的严重程度和终末期肾脏疾病，在相当数量的病例中显示了有希望的结果；同时遗传咨询对患者和家庭都是至关重要的。由羊水过少引起的肺发育不全在许多受影响的婴儿中发生。这些婴儿中约有30%在新生儿期或出生后1年内死于呼吸功能不全或叠加性肺部感染。通过新生儿呼吸支持和肾脏替代治疗，这些婴儿的长期存活率提高到80%以上。新生儿多囊肾病是本年龄段慢性肾脏疾病(CKD)的主要病因之一。由于文献中可获得的研究较少，所以在这个年龄段中CKD的发病率很难确定。因此，Wedekin等[30]报告说，在研究的地理区域，新生婴儿的发病率为万分之一。文献中可获得的大多数研究涉及终末期肾病的发病率和病因学，0～2岁的报道发病率为每百万同龄健康婴儿7.1例。基于所有这些事实，对所有出生第1个月的新生儿进行超声筛查，将有助于确定该病的实际发病率，并预防其与其他严重疾病类似的进一步并发症。一项对来自40个不同国家的264例患者的研究表明，13%的新生儿终末期肾病病例是由囊性肾病、肾脏和尿道的先天性异常(55%)、皮质坏死(11%)和先天性肾病综合征(6%)引起的[31]。随着肾脏替代治疗和肾脏移植的进展，提高了长期存活率，临床肝胆疾病很可能成为ARPKD自然史的一个主要特征。抗高血压治疗明显改善ARPKD患者预后。因此，它可以被认为是ARPKD的一个管理选项。高血压常见于婴幼儿及以后的儿童期ARPKD，它可能是唯一的症状。高血压也见于肾功能正常的患者，几乎所有ARPKD患儿都有高血压表现。如果不能有效地治疗高血压，就可能发生心动过速或充血性心脏病。ARPKD中高血压的发病机制尚不清楚。此外，继发性动脉性高血压可能是其他原因的结果，包括不同的危及生命的中毒，因此对儿童进行鉴别诊断至关重要[32]。血管紧张素转换酶抑制剂是这类高血压的一线治疗药物，尽管与钙通道阻滞剂、利尿剂和-受体阻滞剂一起的研究还很少。目前抗高血压治疗是改善ARPKD患者重要预后的一种共识。此外，由于无法浓缩和稀释尿液而导致的电解质异常，这在早期、严重的ARPKD表现中非常常见，应予以预测和治疗。坚定的营养计划和酸中毒的纠正对优化线性肾脏生长是很重要的。如果发生肾生长损害，可考虑用生长激素治疗[33]。

ARPKD是一种严重的疾病，死亡率很高。随着新生儿时期的治疗进展，患者的生存机会增加。研究证实其预后比预想的好，度过婴儿期的患者预后相对较好，50%～80%的患者可存活15年。然而，由于广泛的相关并发症，这种情况的预后仍是不可预测的。ARPKD目前尚缺乏根治的有效措施，多以对症治疗为主。我们希望通过患者基因组的高通量靶向分析帮助疾病进行准确遗传诊断，同时避免误诊，给临床医生和研究人员能够更好地解释已识别的变异，提高常染色体隐性遗传多囊肾患者的诊断。