阈值法与二阶求导法应用于HCV-RNA荧光定量PCR的精密度比较

杨 辉，马 亮，丛 笑，刘 倩，于 洋

（中日友好医院 检验科，北京 100029）

以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的核酸检测方法特异、敏感，在病原微生物诊断领域应用极广[1~3]。 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA定量检测适用于HCV 现症感染的确认、 抗病毒治疗前基线病毒载量分析以及抗病毒治疗过程中、治疗结束后的应答评估[4，5]。

丙型肝炎治疗过程中的监测与方案调整，在不同程度上依赖HCV RNA 定量结果的稳定性。 我国临床使用的HCV RNA 定量法， 针对同一批扩增曲线采用不同的分析方法对定量结果影响的研究很少。 在实际操作中，阈值法与二阶求导法容易混淆使用。为了解阈值法与二阶求导法对HCV-RNA 定量（外标法）精密度的影响，我们利用临床样本通过Light Cycler480Ⅱ检测系统对2 种分析法进行了比较。

1 资料和方法

1.1 样本来源

6 例HCV 阳性的RNA 样本，来自中日友好医院2018年11~12月医嘱为HCV-RNA 检测的临床样本。

核对采血管，溶血、乳糜、黄疸者未纳入分析。 留样当日提取核酸，-20℃冻存备用。

1.2 试剂与仪器

HCV-RNA 提取与扩增试剂盒购自中山大学达安公司，Smart32 核酸提取仪购自中山大学达安公司，LightCycler480Ⅱ核酸扩增仪购自瑞士罗氏公司。

1.3 方法

HCV-RNA 提取和扩增检测按厂家说明书进行（为减少影响因素，未添加内参模板）。 PCR 反应体系50μl，其中含酶扩增液30μl，核酸上样量20μl。 PCR 循环参数：UNG酶50℃处理15min，95℃预变性15min，94℃变性10s，55℃延伸45s，共反应45个循环，每个循环延伸时读取荧光信号，定量标准品分析使用外标法。

为方便叙述，参考文献[6]，全文用“Ct 法”对应“阈值法”，分析采用“abs/Fit point”模式，用“Cp 法”对应“二阶求导法”，分析采用“abs/2nd Derivative Max”模式。

1.3.1 重复性检测

取6 例阳性核酸制成中等浓度的混合样本，同一实验批次重复25 次检测， 即一个样本获得25 条扩增曲线，扩增曲线先后采用Ct 法和Cp 法进行分析， 平行检测标准品，利用标准曲线计算核酸浓度，并比较二者CV 值差异。

1.3.2 统计分析

采用SPSS 10.0 统计软件进行数据的正态性分析和配对t 检验分析。

2 结果

混合样本重复检测25 次，扩增曲线先后采用Ct 法和Cp 法进行分析， 计算核酸浓度和组内变异系数CV 值，阈值法CV 为23.12%，二阶求导法CV 为7.75%；采用SPSS 10.0 统计，2组浓度值均呈正态性分布；应用配对t 检验，2组值存在统计学显著差异（P=0.008）；与Ct 法分析比较，Cp 法分析得到的定量浓度的重现性更好（见图1）。

3 讨论

阈值法和二阶求导法广泛应用于real-time PCR 荧光定量（外标法）检测。 阈值选择与群体特征有关，要综合考虑所有阳性曲线的形状；扩增曲线连续二阶求导，最大值对应的循环数，近似指数扩增期的终点[7]，是唯一值，与其他扩增曲线无关。所以，从数据的获得过程来说，二阶求导法获得的Cp 值要比阈值法获得的Ct 值更为稳定。

real-time PCR 荧光检测的定量模型能放大检测误差。它的定量原理为lgC=K*Ct+B，是一个能变形为指数函数的对数模型。 模型的输入数据为Ct 值，输出数据为核酸浓度C。 通过这个定量模型，Ct 值的绝对误差被转换成核酸浓度C 的相对误差。 Ct 值与真值相差1个单位，核酸浓度C与真值就可能相差1 倍，输入数据的误差被显著放大。 因此， 控制好输入数据Ct 值的稳定性将获得明显的精密度收益。 减少模型输入数据的变异系数，如使用二阶求导法取代阈值法可以减少核酸浓度的定量误差。 所以，我们认为， 使用real-time PCR 技术定量监测丙肝患者的病毒载量变化时，优先选用精密度较高的二阶求导法，其数据更为客观。