三维培养在妇科恶性肿瘤研究中的应用

高英 周君涵 朱雪琼

妇科恶性肿瘤是严重威胁妇女生命健康的一组恶性疾病[1]。目前对于妇科恶性肿瘤多采取手术为主、放化疗为辅的综合治疗手段，但由于部分患者未能早期诊断，部分化疗药物易产生耐药等多种因素[2]，导致治疗效果欠佳。因此迫切需要研发新的靶向化疗药物，从而抑制肿瘤进展及预防肿瘤复发。

在新型抗癌药物进行临床试验之前，需要先进行临床前研究以确保其安全性和有效性，研究的第一步通常是体外细胞实验。目前体外肿瘤细胞实验多采用传统的二维培养方法，其具有成本低、操作简单、培养环境易控制、观察指标较直观等优点。然而，二维培养尚存在较多局限，例如结构过于简单，细胞和细胞外环境之间相互干扰，导致细胞形态、极性和分裂方法的变化等[3]。除此之外，在二维培养条件下肿瘤细胞常呈单层贴壁生长，细胞与细胞或细胞外基质（extracellular matrix，ECM）接触很少，缺乏细胞与细胞或ECM间的相互作用，与体内肿瘤真实的生长微环境存在差异，不能准确反映肿瘤在体内的真实生长情况。

三维培养技术能够很好地弥补二维培养的不足[4]。三维培养是指利用各种方法和材料，使细胞在空间上呈立体方式生长，更接近于体内生长状况，形成类似于体内组织的结构，并发挥其功能。与传统的二维单层培养相比，三维培养为肿瘤细胞在体外的生长提供类似于体内生长环境的生物支撑或基质，使肿瘤细胞呈立体球状生长[5]。除此之外，在三维培养条件下，细胞与细胞或ECM间充分接触并建立相互联系[6]。研究表明，应用三维培养技术构建的体外肿瘤模型与体内肿瘤具有相似的形态学和细胞生物学特性[7]。本文拟对三维培养在妇科肿瘤研究中的应用作一综述，并展望其应用前景及意义。

1 三维培养在卵巢癌研究中的应用

1.1 肿瘤微环境对卵巢癌细胞影响的研究 Cai等[8]从卵巢囊肿患者的大网膜中和上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）转移的大网膜中分离出原代人成纤维细胞，并分别与EOC细胞在体外建立三维共培养模型，用于研究大网膜成纤维细胞和EOC细胞之间的相互作用，结果发现与未被癌细胞激活的成纤维细胞相比，大网膜中肿瘤细胞激活活化的成纤维细胞，即癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）形成一个适宜的环境，以促进卵巢癌细胞细胞植入大网膜，从而促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，该三维培养模型提示大网膜中CAFs与卵巢癌的转移密切相关。Touboul等[9]从羊膜中提取间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC），并使用羊膜支架构建卵巢癌细胞和MSC的体外三维共培养模型，用以研究卵巢癌细胞和MSC之间的相互作用，结果发现在MSC和卵巢癌细胞共培养的情况下，大多数肿瘤位于富含MSC的区域，在富含MSC的区域内肿瘤浸润更深，且在共培养条件下较高的白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）分泌可以增强卵巢癌细胞的侵袭，在拮抗IL-6受体后，卵巢癌细胞浸润明显减少（主要在富含MSC的区域中），表明MSC通过分泌IL-6促进卵巢癌细胞的浸润，提示三维共培养模型为研究卵巢癌细胞浸润微环境提供较好模型。

1.2 卵巢癌细胞生物学行为研究 体外研究发现受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptors 1，ROR1）和受体酪氨酸激酶样孤儿受体 2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptors 2，ROR2）在卵巢癌转移中起重要作用[10]，但是，当使用二维培养模型来研究癌细胞的迁移时，不能研究间质细胞参与的癌细胞转移。为了深入研究ROR1和ROR2在肿瘤细胞和间质细胞中的作用，Henry等[11]收集来源于女性良性或非转移性妇科恶性肿瘤新鲜大网膜样品中分离的原代成纤维细胞和间皮细胞，用胶原蛋白培养构建器官型三维培养模型，并将ROR1、ROR2和双ROR1/ROR2的稳定短发夹RNA敲低的卵巢癌细胞接种到三维培养模型上以分析比较各组之间癌细胞黏附和侵袭能力的差异，结果发现同时敲低卵巢癌细胞ROR1和ROR2基因强烈抑制癌细胞黏附和侵袭到大网膜模型，表明ROR1和ROR2联合可明显影响卵巢癌细胞向大网膜的转移。Henry等[12]还在卵巢癌相关基质中发现了ROR2的上调，但没有发现ROR1的上调，并且卵巢癌相关基质中过表达的ROR2增加卵巢癌细胞的迁移，表明ROR2可能在间质细胞参与的癌细胞转移中起作用。这些结果强调了使用复杂的器官型三维模型能够更好地研究体外受体对癌细胞生物学行为的影响。由于传统的二维培养模型不能准确再现人体大网膜的微环境，人们对早期卵巢癌转移的生物学机制知之甚少，Kenny等[13]使用卵巢癌细胞和正常大网膜中分离的原代成纤维细胞、间皮细胞、胶原等开发了一种模仿人体大网膜的器官型三维共培养模型，用以研究卵巢癌细胞的早期转移，其结果显示当卵巢癌细胞黏附于大网膜时，基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）在卵巢癌细胞中被上调和水解活化，活化的MMP-2将ECM裂解为小片段，裂解的ECM片段随后通过与其同源整联蛋白受体结合而促进卵巢癌细胞黏附和侵袭，该实验结果强调了三维培养模型对于研究早期卵巢癌转移的生物学机制具有重要意义。

1.3 抗卵巢癌药物筛选研究 由于用于初级药物筛选的传统二维细胞培养方法并不能很准确地反映恶性肿瘤的自然进展。Cha等[14]研究了成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）1/2/3选择性抑制剂BGJ398对单层培养和球形培养条件下的卵巢癌SKOV3ip1细胞的抗肿瘤活性，采用结晶紫染色试验检测抑制剂处理前后的细胞活力，结果发现在BGJ398处理48和72h的单层培养的卵巢癌细胞中，细胞活力降低不明显；而在球形培养的卵巢癌细胞中，细胞活力明显降低，且呈时间依赖性，表明肿瘤细胞的三维培养模型对于抗卵巢癌药物筛选具有重要意义。Hirst等[15]在三维细胞培养物中培养了一组EOC细胞系，以形成多细胞肿瘤球体，并使用二维细胞培养物进行对比筛选，以鉴定先前未鉴定出有抗肿瘤活性的抗癌药物，结果发现licofelone和glafenine在卵巢癌三维细胞培养物中具有较强的抗肿瘤活性，但是这些药物仅用传统的二维药物筛选并未能鉴定出有抗肿瘤活性，提示使用体外球体三维药物筛选模型对于抗卵巢癌药物筛选具有重要作用。

2 三维培养在乳腺癌研究中的应用

2.1 肿瘤微环境对乳腺癌细胞的影响研究 ECM相关黏附蛋白以及肿瘤基质硬度是转移的重要决定因素。由于传统的二维培养不能考虑肿瘤微环境中的ECM硬度，因此当研究ECM相关黏附蛋白（包括Ras抑制因子-1）在细胞侵袭方面与基质硬度的关系时，不能使用传统的二维单层培养物。Gkretsi等[16]采用增加浓度和硬度的三维胶原蛋白Ⅰ凝胶来嵌入不同侵袭性的乳腺癌细胞和肿瘤球状体来研究ECM相关黏附蛋白与基质硬度的关系，结果发现Ras抑制因子-1在基质硬度增加的条件下显著上调；而由Ras抑制因子-1敲除的细胞形成的肿瘤球体在所有乳腺癌细胞系中以及不同基质硬度条件下均丧失其侵袭能力，表明Ras抑制因子-1在乳腺癌转移中起重要作用。Daubriac等[17]开发了一种由乳腺癌MDA-MB-231细胞、CAFs和胶原凝胶组成的三维共培养模型，用以研究CAFs和癌细胞之间的相互作用如何调节癌细胞的侵袭性，结果显示CAFs和乳腺癌细胞之间的相互作用增加了CAFs中胰岛素样生长因子-1的分泌和癌细胞中纤溶酶原激活物抑制剂-1的活性，而胰岛素样生长因子-1和纤溶酶原激活物抑制剂-1均可激活癌细胞中的RhoA/ROCK信号传导，进而增加癌细胞的扩散和侵袭性。因此，三维共培养模型可明确CAFs调节乳腺癌细胞侵袭性的相关通路。

2.2 乳腺癌细胞生物学行为研究 为了研究不同培养条件下DNA甲基化与乳腺癌发生、发展之间的关系，Wang等[18]分别在二维和三维培养条件下培养乳腺癌MCF-7细胞，并分析检查乳腺癌细胞CpG位点的甲基化状态，结果发现不同培养条件下乳腺癌细胞的DNA甲基化状态无明显差异，但是DNA甲基化异常与乳腺癌的发生有关。Toh等[19]开发了一种基于微流体的培养芯片，在该微流体芯片中，三维微环境被设计成在三维肿瘤模型中培养转移性乳腺癌细胞（MX-1），同时掺入化学引诱剂以刺激乳腺癌细胞穿过膜的运动性，并通过跟踪系统中癌细胞的运动性来验证芯片的有效性，结果发现在微流体癌细胞迁移模型中，MX-1细胞能够在45h内穿过胶原屏障侵入侧灌注通道，并能保持其细胞-细胞接触做集体侵入运动，表明与传统的监测癌细胞迁移的Boyden室相比，该系统可以实时监测癌细胞迁移，提示三维微流体培养芯片对于监测乳腺癌细胞运动具有重要意义。

2.3 抗乳腺癌药物筛选研究 由于浸润性乳腺癌患者易对常规的化疗药物产生耐药，Borges等[20]提出了一种新的治疗策略，即将DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨与苏拉明相结合，在三维细胞培养中测定苏拉明、地西他滨和两者的联合治疗对乳腺癌细胞的毒性反应以及对细胞侵袭性的影响，结果发现在三维培养条件下，单独苏拉明或地西他滨对肿瘤细胞生长没有明显的抑制和毒性反应，对细胞侵袭也没有明显的抑制作用，即使两种药物的联合应用，对乳腺癌细胞的生长亦无明显的抑制作用，但能够有效地阻止癌细胞侵入周围的ECM，表明使用地西他滨和苏拉明的联合治疗虽然无抑制癌细胞生长作用，但明显降低乳腺癌细胞的侵袭潜力，提示苏拉明和地西他滨联合可用于治疗侵袭性、多药耐药性乳腺癌。Hashemzehi等[21]在三维培养模型中评估了植物体包裹的姜黄素抗乳腺癌MCF-7细胞的活性，结果发现在三维培养模型中，随着植物体姜黄素浓度增加，乳腺癌细胞的存活率和侵袭能力逐渐下降，尤其是乳腺癌细胞的侵袭力，提示植物体姜黄素以剂量依赖性方式抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长并且明显降低其侵袭能力，表明植物体姜黄素能够抑制乳腺癌细胞的生长和侵袭，为进一步研究这种新型抗癌剂抗乳腺癌的作用提供试验依据。以上研究提示，三维培养技术对于筛选治疗乳腺癌的新型化疗药物或联合化疗方案均具有重要的意义。

3 三维培养在子宫内膜癌研究中的应用

3.1 子宫内膜癌细胞生物学行为研究 Grun等[22]使用旋转细胞培养法建立子宫内膜癌细胞的三维培养模型，并与建立在二维培养中的相同细胞和原发性肿瘤的形态学特征进行比较，结果发现与肿瘤细胞的二维单层培养物相比，三维多细胞球体呈簇状生长，类似于乳头状结构，细胞呈多形性，细胞核增大，核仁明显，还存在有丝分裂细胞；三维多细胞球体与具有子宫内膜乳头状结构的原发肿瘤具有相似的形态学特征，表明三维细胞系的生长模式与原发肿瘤的形态学具有高度相似性，提示建立癌细胞系的三维培养模型对于研究子宫内膜癌的生长模式具有重要价值。Yamamoto等[23]采用三维培养方法研究子宫内膜癌细胞系（Ishikawa，HEC1A和AN3CA）的形态和AF-6/afadin表达，使用Matrigel侵袭测定来证明AF-6/afadin敲低后子宫内膜癌细胞侵袭能力的变化，结果发现AF-6/afadin敲低导致三维细胞培养物中腺样结构的数量减少，子宫内膜癌细胞侵袭能力增强，提示AF-6/afadin的表达缺失可诱导子宫内膜癌细胞侵袭，但抑制腺体结构的形成。以上研究表明，三维培养技术的应用有力推动了对子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭等生物学行为的研究。

3.2 子宫内膜癌细胞对化疗药物的敏感性研究 晚期子宫内膜癌患者常表现为对化疗药物的耐药。Chitcholtan等[2]使用悬浮培养法培养出子宫内膜癌细胞的三维多细胞结构，并比较了多柔比星和顺铂在子宫内膜癌三维多细胞结构和二维单层培养物中的抗肿瘤活性，结果发现多柔比星和顺铂在三维多细胞结构中诱导的细胞凋亡少于二维单层培养物，且三维多细胞培养物比细胞单层培养物具有更高的活力，表明与二维培养物相比，三维多细胞结构对检测化疗药物敏感性表现出更大的优势。

4 三维培养在宫颈癌研究中的应用

Zhao等[24]使用宫颈癌Hela细胞、明胶、藻酸盐、纤维蛋白原水凝胶为原料，并采用3D打印方法构建宫颈癌体外培养模型。在宫颈癌3D打印模型中测量细胞增殖、MMP表达和化学抗性，结果发现与二维培养相比，3D打印模型中的Hela细胞显示出更高的增殖速率、更高的MMP表达水平和更强的化疗药物的耐药性，提示新的三维细胞打印技术可以促进三维癌症研究的发展。

5 结语

综上所述，与二维单层细胞培养相比，妇科恶性肿瘤细胞的三维立体培养模型与体内肿瘤具有更为相似的形态学特征和细胞生物学特性，能够较准确地模拟体内肿瘤生长的真实情况。三维培养技术在研究妇科恶性肿瘤微环境、细胞生物学行为和筛选抗肿瘤药物等方面具有重要意义。但三维培养技术仍然有些地方需要改进，例如操作耗时长、难以控制肿瘤球的大小和均一性等，尚需进一步研究不断完善，以满足临床研究。