甲状腺乳头状癌术前细针穿刺标本核酸检测BRAF V600E方法的探讨

顾华敏 曹学全 杨朝晖 章辉 潘海

超声引导下甲状腺细针穿刺结合鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（BRAF）基因V600E突变检测（简称BRAF V600E检测）可在甲状腺乳头状癌的术前辅助诊断中发挥重要作用[1]。目前，许多三级医院病理科开展了BRAF V600E检测，检测时若直接刮取液基细胞切片上的肿瘤细胞用于检测前的质控会破坏原来的液基细胞切片，而直接使用穿刺组织提取核酸则无法进行质控，结果有一定的盲目性，不能排除假阴性。本研究对两种不同方法获取的突变检测结果，以术后常规肿瘤组织标本检测结果为金标准进行对比，探讨使用剩余标本进行检测的可行性。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2018年5至12月本院甲状腺乳头状癌细针穿刺标本101例，分两组，均收集细胞学液基细胞切片及液基细胞学制片剩余标本、对应术后常规肿瘤组织标本。第一组82例，细胞学镜下均找到乳头状癌细胞（常规手术后病理诊断均为甲状腺乳头状癌），且癌细胞个数≥200个；其中男29例，女53例；年龄40～68（43.0±11.5）岁。第二组19例，细胞学结果为可疑滤泡性肿瘤，且肿瘤细胞个数≥200个，其中男5例，女14例；年龄 35～57（42.0±12.3）岁。所有患者均无高血压、冠心病、肝肾功能障碍、精神异常及长期应用药物及其他肿瘤病史。

1.2 主要试剂 人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒（24测试/盒，批号：11218103002X），核酸（DNA）提取试剂盒（36测试/盒，批号：12218112101X）均购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 方法一 直接在细胞学液基细胞切片上刮取足够肿瘤细胞提取核酸进行BRAF V600E检测，具体如下：直接在液基细胞切片背面用金刚笔圈出达到质控要求的肿瘤细胞范围，去掉盖玻片，用二甲苯洗去中性树胶，滴加吐温20，再用一次性刀片刮取标记组织，小心移至1.5ml EP管备用，并在液基细胞切片上留足支持细胞学诊断依据的肿瘤细胞；加入1ml无水乙醇，振荡混匀10s，室温下13 000×g离心2min，小心去除上清液（勿吸到沉淀）；室温开盖放置10min或37℃下开盖放置5min，使乙醇充分挥发。后续操作同术后常规肿瘤组织样本核酸提取及聚合酶链式反应（PCR）检测方法一致，根据DNA提取试剂盒说明书，依次加入裂解缓冲液液、蛋白酶K、结合缓冲液、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、洗脱缓冲液提取DNA；之后，使用紫外分光光度计ND5000（北京百泰克生物技术有限公司）测定DNA浓度，DNA浓度光密度（OD）260/OD280介于1.8～2.1之间。使用美国ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测，PCR反应条件为第一阶段：95℃ 5min，1个循环；第二阶段：95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15 个循环；第三阶段：93℃25s，60℃ 35s，72℃ 20s，31 个循环。信号收集：第三阶段60℃时收集外控信号和内控信号，执行实时PCR检测，保存文件。每批次PCR反应中，每份样品必须和阳性质控品、阴性对照共同进行检测和分析。

1.3.2 方法二 先通过细胞学液基细胞切片进行肿瘤细胞质控评估，再用制作同例细胞学切片的剩余标本提取核酸进行BRAF V600E检测：将对应液基细胞学切片剩余标本导入50ml试管中，2 000r/min离心10min（细胞室离心机），移去上清液，剩余1ml左右，用1 000μl移液枪转移入1.5ml的EP管中，13 000×g离心2min，去除上清液；如有红细胞，再加入1ml 0.9%氯化钠溶液破红，振荡，13 000×g离心2min，打开离心管盖子，室温或56℃晾干，约10min；后续步骤操作同术后常规组织标本核酸提取及PCR检测方法一致。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。两种方法检测甲状腺乳头状癌突变率和两种方法结果对比符合率比较采用χ2检验，两种方法检测可疑滤泡性肿瘤突变率比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测甲状腺乳头状癌中BRAF V600E突变率比较 方法一和方法二检测甲状腺乳头状癌中BRAF V600E突变率分别为75.6%（62/82）和73.2%（60/82），两种方法比较差异无统计学意义（χ2=0.128，P＞0.05）。

2.2 两种方法检测细胞学结果为可疑滤泡性肿瘤中BRAF V600E突变率比较 方法一和方法二检测细胞学结果为可疑滤泡性肿瘤中BRAF V600E突变率分别为 5.26%（1/19）和 5.26%（1/19），两种方法比较差异无统计学意义（P=1.000）。

2.3 两种方法与对应术后常规肿瘤组织标本检测BRAF V600E结果的符合率比较 方法一与对应术后常规肿瘤组织标本检测BRAF V600E结果的符合率为100.00%（101/101）；方法二与对应术后常规肿瘤组织标本检测BRAF V600E结果的符合率为98.02%（99/101）；两种方法符合率比较差异无统计学意义（χ2=2.020，P＞0.05）。

3 讨论

本文第一组是先通过细胞学明确找到乳头状癌细胞和术后常规病理诊断为甲状腺乳头状癌的条件初筛标本，再通过“细胞学液基细胞切片进行质控评估肿瘤细胞≥200个”标准入选标本，再对同一患者细胞学液基细胞切片和其细胞学制片剩余标本分别提取核酸进行BRAF V600E检测，比较结果，探讨方法二的可行性。两种方法对比试验共进行3批次，共246人份，同一患者标本，都同批加样扩增分析（实验条件完全一样），虽然提取的核酸浓度不一，造成荧光PCR结果外控信号曲线升起早晚不一，但最后PCR定性结果82例中，方法一和方法二的突变率分别为75.6%和73.2%，与文献报道的突变率结果一致[2-4]。

第二组是收集细胞学结果为可疑滤泡性肿瘤的患者，即非乳头状癌标本，比较结果，探讨方法二的可行性。两种方法对比试验共进行2批次，共57人份，同一患者标本均同批加样扩增分析（实验条件完全一样），虽然提取的核酸浓度不一，但荧光PCR结果外控信号曲线均为水平线，未出现典型上升曲线。其术后常规病理诊断为：甲状腺腺瘤6例，甲状腺腺瘤伴包膜侵犯3例，甲状腺腺瘤样增生结节2例，甲状腺滤泡癌5例，甲状腺微小浸润型滤泡癌2例，甲状腺滤泡性乳头状癌1例，故本组结果中1例滤泡性乳头状癌发生突变。

在所有PCR定性结果101例中，方法一和方法二所提取核酸作BRAF V600E突变检测结果作对比，结果显示两种方法比较差异无统计学意义；但方法一会对原始细胞学阳性切片产生不可逆的破坏，而方法二既可以保留原始细胞学阳性切片作为细胞学诊断依据，又可以对预丢弃剩余标本废物利用达到检测目的，指导临床后续治疗，具有一定的临床价值。由于本研究样本量有限，无法进行大数据比对，但使用剩余标本进行检测具有一定的可行性。

有研究显示甲状腺细针穿刺标本中BRAF V600E突变检测方法可靠，与细针穿刺结合能提高甲状腺结节诊断的准确性，同时可能有助于筛选出高危甲状腺癌患者，更好地发挥BRAF V600E辅助诊断的作用[5-6]。但对于BRAF V600E检测出未突变的患者，应结合临床表现、血液及B超检查征象等，恶性征象偏高的建议手术治疗；恶性征象不高的建议门诊随访，定期复查。