内质网应激在心血管疾病中的研究进展

刘珂珂，黄 涯，吕 梦，娄利霞，程 涓，聂 波，张冬梅，吴爱明，赵明镜

内质网稳态的丧失是多种心血管疾病的病理基础。内质网非常活跃，易受到环境因素的影响。在缺氧、缺糖、三磷酸腺苷耗竭、钙超载等内外环境应激因子刺激下，细胞均可引起内稳态失衡，使未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔积聚，继而激活蛋白质质量控制系统，对蛋白质合成和降解做出适应性调整，以恢复其正常功能。根据诱发原因的不同，内质网应激可分为3类：未折叠/误折叠蛋白激发的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)、过多表达的蛋白质经内质网膜转运激发的过负荷反应以及固醇剥夺激活的级联反应。其中，以UPR与心血管疾病联系最为密切。适度的内质网应激是细胞的自适应反应，有利于内质网功能的恢复，为细胞生存提供了保障。然而，如果内质网应激是严重或持续的，蛋白质错误折叠未得到解决，则会进一步诱发炎症和凋亡，以清除受累细胞。本研究就内质网应激UPR在几种常见心血管疾病中的研究进展进行综述。

1 内质网应激的信号转导途径

内质网应激主要包括蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA-like ER kinase，PERK)、肌醇需要蛋白1(inositol-requiring protein 1，IRE1)、激活转录因子-6(activating transcription factor 6，ATF-6)3条信号转导途径[1]。正常情况下，免疫球蛋白结合蛋白(BIP)/葡萄糖调节蛋白78(GRP78)与PERK、IRE1、ATF-6结合存在，发生内质网应激UPR时，GRP78与误折叠蛋白或未折叠蛋白结合，从而释放PERK、IRE1、ATF-6，引发下游的级联反应。其中IRE1和PERK通过细胞质内结构域二聚化和自身磷酸化而被激活。IRE1可以诱导人X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP-1)表达，XBP-1蛋白与UPR及内质网相关降解途径(ER-associated degradation，ERAD)基因促进子结合，促进降解。PERK则磷酸化真核细胞起始因子 2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)第51位丝氨酸，阻断蛋白质信使RNA(mRNA)的翻译，也可选择性活化转录因子-4(activating transcription factor-4，ATF-4)的翻译，从而增加伴侣分子的合成，上调与氧化应激相关基因的表达。ATF-6则以囊泡转移的途径转入高尔基体，被蛋白酶水解成活性转录因子。活化的ATF-6被转移至细胞核，与通用性转录因子(nuclear factor-Y)以二聚体形式结合于内质网应激基因的启动元件，进而诱导这些蛋白的转录表达。通过上述过程，瞬时抑制蛋白质翻译，增强内质网的蛋白质折叠能力，加快内质网相关的降解，使变性蛋白得以清除，从而恢复细胞内稳态[2]。如果以上3条途径仍不能缓解，过度的应激则会激活ERAD过程，通过泛素化靶蛋白进而被蛋白酶体所水解，也可激活细胞自噬及凋亡途径。通过内质网特有的半胱氨酸蛋白酶12(Caspase-12)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、c-Jun氨基末端激酶通路引起细胞凋亡。

2 内质网应激与心血管疾病

2.1 心肌梗死 急性心肌梗死是威胁人类健康的重大疾病。介入治疗使心肌梗死病人的生存率大幅提高，但介入术后往往会发生不同程度的缺血/再灌注损伤(infarction/reperfusion，I/R)，在一定程度上影响了疗效。已有证据表明，内质网应激及其引起的凋亡在I/R这一病理过程中发挥着重要的作用。内质网应激在心肌I/R时被激活，GRP78作为内质网应激的主要调节因子此时表达上调。有研究表明，GRP78可以刺激蛋白激酶B(Akt)信号通路使其表达增强，从而抑制活性氧的积累，继而发挥减轻心肌细胞损伤的作用[3]。而ATF-6作为GRP78的下游分子，在心肌梗死及I/R病理过程中也发挥着保护性作用。有研究表明，激活ATF-6可以减轻氧化应激，调节钙离子平衡并减轻内质网压力[4]。ATF-6的抗氧化作用与其增加过氧化氢酶等抗氧化蛋白的表达，阻断线粒体Ras系统的激活有关[5]。相反，基因敲除ATF-6会影响肾上腺素-胰岛素样生长因子信号传递，进而使脑内富集的Ras同系物(Ras homologue enriched in brain，RHEB)基因表达雷帕霉素靶蛋白(mTOR1)增加，抑制自噬，导致心肌进行性肥大[6]。

虽然，GRP78和ATF6的激活这一适度的内质网应激反应对机体有益。但是，在心肌梗死及I/R病理过程中的内质网应激往往是持续而严重的，表现为CHOP和Caspase-12的激活，最终导致细胞过度凋亡，心功能受损[7]。因此，抑制过度的内质网应激可作为治疗心肌梗死减轻I/R的重要干预途径。研究发现，化学伴侣4-苯基丁酸钠(PBA)可以降低内质网应激水平，从而减少心肌细胞的凋亡，缩小梗死面积并改善心功能[8]。通过抑制亲环素D蛋白(cypD)也可减轻心脏I/R中过度的内质网应激水平，减少线粒体通透性转化孔的开放，起到减轻I/R损伤的作用[9]。此外，在内皮细胞缺氧/复氧实验中，同样发生着过度的内质网应激，GRP78、磷酸化Caspase12、CHOP的表达均增加，细胞发生过度凋亡，而乙酰胆碱可通过3型毒蕈碱乙酰胆碱受体(M3AchR)激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路，抑制内质网应激相关的凋亡通路，还可保护内质网超微结构，从而发挥积极作用[10]。

可见，抑制过度的内质网应激对心肌梗死的治疗有益。近年来，大量研究证实中药的作用机制也与减轻过度的内质网应激密切相关。柚皮素可通过参与内质网应激的3条经典信号通路，改善I/R中过度的内质网应激和细胞凋亡[11]。红景天苷可通过作用于PERK和IRE1通路，抑制过度的内质网应激，从而减轻大鼠胚胎心肌细胞H9C2的缺氧/复氧损伤[12]。黄芪甲苷可作用于GRP78、葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein 94，GRP94)、IRE1，抑制内质网应激，阻止线粒体通透性转化孔的开放[13-14]。而番茄红素可减少内质网应激相关蛋白GRP78、ATF-6、剪接型XBP-1、elF2α、磷酸化elF2α和凋亡相关蛋白CHOP、Bcl-2相关的X蛋白(Bax)、Caspase-12及半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达而发挥对心肌细胞的保护作用[15-16]。

2.2 糖尿病性心脏病 糖尿病性心脏病是导致糖尿病病人发生心力衰竭和死亡的重要原因，临床上以心室肌的扩张与肥厚，同时伴随左室舒张及收缩功能障碍为特点，而内质网应激在糖尿病性心脏病发生发展过程中发挥着重要的作用。研究发现，高血糖介导的氧化应激会影响内质网伴侣蛋白的催化功能，如蛋白二硫键异构酶(PDI)、蛋白二硫化物异构酶A3(ERp57)和葡萄糖调节蛋白94(GRP94)[17]，这些伴侣蛋白可以导致错误折叠蛋白的积累，从而激活UPR传感器，恢复内质网的正常功能[18]。然而，在短暂的自适应后，往往会发生过度的内质网应激，抑制过度的应激可减轻糖尿病性心脏病心肌损伤。研究表明，促红细胞生成素通过抑制糖尿病性心脏病过度的内质网应激，减轻大鼠心脏功能障碍[19]。钠-葡萄糖共转运体2抑制剂Empagliflozin抑制内质网应激，减少GRP78、CHOP、Caspase-12、XBP-1、激活转录因子-4(ATF-4)和肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)的表达，从而改善糖尿病性心脏病[20]。也有研究表明，基因CNR1缺失会促进AMPKα激活，减少应激相关蛋白PERK、ATF-4、ATF-6和eLF2α的表达，改善内质网应激和胰岛素抵抗，预防代谢应激诱导的心脏损伤[21]。

糖尿病性心脏病病人常会发生心肌重构，进而加重病情，抑制内质网应激可以改善心肌重构和心脏收缩功能障碍。如敲除rac1基因可阻断高糖诱导的内质网应激，减少应激相关蛋白GRP78、磷酸化PERK(p-PERK)等的表达，减轻心肌重构[22]。心肌组织重构包括心肌实质和间质的重塑，而心肌实质重塑是指心肌细胞肥大、坏死和凋亡。研究发现，糖尿病性心脏病会导致内质网应激相关分子PERK、IRE1、ATF-6的过度激活，而阻断内质网应激的PERK信号通路可减轻Ros介导的糖尿病心肌细胞凋亡[23]。抑制过度的内质网应激同样是许多中药提取物的潜在作用靶点。如人参素Ginsenosiderg1通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡，起到改善糖尿病性心脏病的作用[24]；其他如黄芪多糖、桑白皮提取物也可通过调节内质网应激而减轻糖尿病心肌损伤[25-26]。也有研究表明，苦参碱通过影响ATF-6信号通路减轻糖尿病性心脏病心肌纤维化，进而改善心功能[27]。

2.3 肥厚性心肌病 内质网应激参与肥厚性心肌病的发生发展过程。研究发现，心肌组织中Myozap蛋白可通过SRF信号通路过表达，使心肌细胞的蛋白聚集增加，引发UPR、自噬和凋亡，导致心肌病的发生[28]。在心肌病的进展阶段，心肌细胞肥大是肥厚性心肌病的关键病理机制之一，内质网应激参与其中。脂肪素(Apelin)是G蛋白结合受体APJ的内源性配体，研究表明，Apelin-13可导致活性氧的产生和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4的表达增加，从而导致心肌细胞肥大。此外，Apelin-13处理可剂量依赖性地增加细胞中两种内质网应激标志物GRP78和CHOP的表达，而用NADPH抑制剂可阻断Apelin-13诱导的GRP78和CHOP表达增加。可见，内质网应激参与Apelin-13诱导NADPH导致心肌细胞肥大这一过程[29]。心肌纤维化是肥厚性心肌病的关键病理基础，内质网应激同样参与其中。研究发现，TXNDC5是一种新型的心肌纤维化介质，可通过转化生长因子-β(TGF-β)-UPR-ATF-6轴调节纤维化，使心脏成纤维细胞活化，胶原蛋白合成增加等，而靶向TXNDC5是一种新的改善心肌纤维化，提高心功能的策略[30]。

心肌肥厚与过度的内质网应激有关，抑制过度的内质网应激改善心肌肥厚已在许多研究中得到了证实。如c1q-肿瘤坏死因子相关蛋白3(CTRP3)是一种脂肪因子，可通过抑制P38通路，减轻内质网应激，进而减轻肥厚和纤维化，恢复左室功能[31]。陆薇薇等[32]的研究也表明，降钙素基因相关肽家族成员Intermedin1-53通过激活AMPK信号通路，显著抑制内质网应激相关分子的表达及减少凋亡，从而改善心肌肥厚。

近年来，研究发现，一些中药提取物也可通过抑制内质网应激来达到改善肥厚性心脏病的作用。小檗碱通过抑制压力负荷所致的内质网应激，减少相关蛋白GRP78和CHOP的表达，显著改善心肌肥厚及心功能紊乱，抑制心肌细胞凋亡，对肥厚型心肌起保护作用[33]。也有研究表明，白藜芦醇通过下调内质网应激相关因子GRP78、CHOP和Bax的表达，上调Bcl-2的表达，发挥改善心肌肥大的作用[34]。

2.4 心力衰竭 心力衰竭是多种心脑血管疾病发展的终末阶段，病死率高，病理机制复杂。而由内质网、泛素蛋白酶体系统、自噬溶酶体系统构成的质量控制系统失调，对于心力衰竭来说，是一种新的病因机制[35]。内质网的质量控制机制UPR，依赖于分子伴侣，会区别对待错误折叠的蛋白质，确保了蛋白的正常生产和处理。适度的内质网应激对心力衰竭是有益的。研究发现，Pak2是一种定位于心肌细胞内质网膜附近的应激反应性激酶。在应激或压力过载作用下，Pak2缺失小鼠的心脏表现为内质网反应缺陷，心功能障碍，而调节Pak2可以促进保护性的内质网应激。进一步研究发现，Pak2主要通过IRE1/XBP-1途径增强内质网功能，改善心脏功能，减少凋亡，从而对心力衰竭起改善作用[36]。

内质网应激在不同的细胞环境或不同的疾病进展阶段发挥截然相反的作用，而在心力衰竭这一疾病中，非可控的严重的内质网应激被激活。GRP78在心力衰竭病人中被发现表达增加，提示在心力衰竭中UPR激活。此外，心力衰竭病人表现出内质网结构改变以及参与UPR反应的内质网蛋白的失调，如GRP78、ATF-6、XBP-1[37]。相关研究也表明，通过抑制内质网应激IRE1的激活和XBP-1的剪接，胆汁酸结合牛脱氧胆酸(TUDCA)抑制UPR，在钙网蛋白过表达引起的心力衰竭模型中可降低心肌纤维化[38]。另外，在大鼠心力衰竭模型中，通过调节内质网应激标志物如Caspase12、CHOP和GRP78被认为是阿托伐他汀保护心脏免受心力衰竭的机制之一[39]。

在心力衰竭中，过度的内质网应激也会导致心肌电重构，心肌细胞间离子通道平衡失调导致心肌电信号紊乱，引发各种类型心律失常，威胁病人生命。研究发现，过度激活的UPR通过下调主要的心脏离子电流，导致心肌细胞发生电重构。首先，PERK和IRE1都下调了心肌特异性钠通道SCN5a(Nav1.5)、钾通道hERG和KvLQT1。其次，PERK专门下调电压门控性钾通道4.3亚型Kv4.3，而IRE1分支下调L型电压门控性钙离子通道Cav1.2。可见，UPR作用于离子通道参与电重构，而靶向UPR减轻电重构可以治疗心律失常，改善心力衰竭病人的预后[40]。在心力衰竭的治疗方面，中医药的作用机制也与内质网应激有关。已有研究发现，复方真武汤可降低GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表达，改善心力衰竭大鼠心室重构，减少心肌细胞凋亡和心肌纤维化，治疗心力衰竭[41]。

3 小 结

内质网是生物体重要的细胞器，其凭借庞大的膜结构而成为协调信号转导的平台，在蛋白质合成与加工、脂质合成、钙动态平衡等方面均发挥重要作用。各种原因导致未折叠蛋白蓄积或钙稳态的失衡均可引起内质网应激。初期以激活保护信号通路促进细胞功能恢复为主，但程度过强或时间过长则诱导凋亡启动因子的表达，导致凋亡事件的发生。内质网应激在心肌梗死、糖尿病性心肌病、心肌肥厚、心力衰竭等多种心血管疾病中的双向作用，对于这些疾病的发生、发展、预后均起至关重要的作用。在病理生理条件下，UPR信号分子也可与其他信号通路相互作用，包括氧化应激、自噬、炎症等。因此，靶向UPR信号通路的药物有望成为治疗这些心血管疾病提供新的思路。近年已有研究提示中医药治疗心血管疾病的作用机制与内质网应激有关。可以预见深入研究中医药对内质网应激的调节机制，对于心血管疾病的防治具有积极意义。