蛋白质二硫键异构酶（PDI）家族在生殖领域中的研究进展

许睿真 李洋洋 综述 丁之德 审校

1. 上海交通大学医学院2016 级生物医学科学专业（上海 200025）2. 上海交通大学医学院组织胚胎学与遗传发育学系（上海 200025）

半个世纪前，蛋白质二硫键异构酶（PDI）是第一个被表征的蛋白质折叠催化剂。它通过显示其氧化还原酶和氧化还原调节的伴侣活性，在各种生理活动中扮演了重要角色。PDI 是蛋白质二硫键异构酶家族成员之一，近年来在神经退行性疾病、代谢性疾病、呼吸道炎症和癌症等多种疾病的发病机制中已被证实其重要作用。然而，PDI 蛋白家族在生殖领域虽有报道，但功能及机制尚不明确，本文将对PDI 蛋白家族的结构、功能以及在生殖领域中的作用和进展进行综述。

一、PDI 家族成员、结构及在内质网中的作用

（一）PDI 家族成员

PDI 家族中所有成员都是硫氧还原蛋白（thioredoxin,TRX） 超家族中的一部分，TRX 超家族还包括谷氨酰还原酶(glutaredoxin,Grx)，硫氧还原蛋白等[1]。迄今为止，PDI 家族共由21 个成员组成，主要成员有PDI（P4HB)、AGR2（PDIA17）、CASQ2（PDIB2）、ERp27（PDIA8）、 PDIA2（PDIp）、ERp57（PDIA3）、TMX1（PDIA11）等,其表达、定位、大小和功能各不相同。

（二）PDI 家族蛋白结构

作为TRX 超家族成员，PDI 家族的共同结构特征是至少拥有一个硫氧还原蛋白样折叠结构的结构域，即βαβαβαββα。大多数PDI 家族成员都包含催化和非催化的硫氧还原蛋白样结构域，这两种结构域分别被称为a 和b 型域，a'、b'则代表结构域在蛋白质中所处的相对位置[2]。a 和a'结构域在功能上类似于TRX，并且每个都包含催化的CXXC（Cys-x-x-Cys，CXXC）结构域，具有氧化还原酶活性，其中经典的基序则是Cys-Gly-His-Cys。b 和b'结构域没有催化活性，其作用似乎是活性区域间的间隔区，并通常负责底物的募集。另一方面，PDI家族蛋白并非每种都同时拥有催化基序a 和非催化基序b，如PDI 作为最常见的PDI 家族成员，其结构域组成 为a，b，b' 和a'，拥 有 类 似 结 构 的 成 员 还 有PDIp、ERp57 等，但有些PDI 家族成员仅含催化基序a 而没有非催化基序b，如ERp18、ADR2 等，而有些成员则仅有非催化基序，如ERp27。PDI 蛋白质家族的另一个共同特征是存在一个由Lys-Asp-Glu-Leu-like 序列组成的COOH 末端ER 保留序列[2]，仅有四种PDI 蛋白家族成员不包含该序列。另外，具有a，b，b'，a'结构域成员其b'和a'域之间有一个较短的域间区域，称x 链接子。

（三）PDI 家族蛋白在内质网中的作用

1.提供形成二硫键的环境

PDI 家族蛋白在细胞内主要定位于内质网，也有少量分布于其他亚细胞结构。内质网是参与蛋白质折叠的主要细胞器，PDI 家族在促进蛋白巯基- 二硫键转换、二硫键形成及重排中均有着重要的作用，并具有分子伴侣的活性。另一方面，内质网比起细胞质更有利于二硫键形成：即拥有更低的还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）比例。在细胞质中，谷胱甘肽主要是还原型，而氧化谷胱甘肽的浓度非常低，这种高GSH/GSSG 通过由与NADPH 偶联的谷胱甘肽还原酶组成的稳健性还原途径得以维持，而该系统可抑制二硫键形成。另外，与NADPH 偶联的TRX 和TRX 还原酶也可以抑制细胞质内蛋白形成二硫键[3]。相反，内质网不含谷胱甘肽还原酶或TRX 还原酶及其同源物，因此GSH:GSSG 的比例较低，即利于二硫键形成。

2.在二硫键形成中的作用机制

PDI 蛋白家族可催化内质网蛋白二硫键的形成。不同PDI 家族成员的TRX 结构域数量和位置及其活性部位的化学性质不同。这些成员通过在二硫键形成（氧化反应）中充当电子受体，或在二硫键断裂（还原反应）过程中充当电子供体，催化硫醇- 二硫键交换反应。PDI 蛋白还通过催化异构化反应将非天然二硫键重排为天然二硫键。特定PDI 蛋白充当氧化剂或还原剂的能力取决于CXXC 活性位点的氧化还原电势。与胞质TRX 的CXPC 基序相比，大多数PDI 蛋白都含有相对不稳定的活性位点二硫键, 而ERdj5 是一个例外，它包含四个CXXC 结构域，其中三个包含CXPC 结构域，在其N 端含有一个J 结构域。与胞质TRX 相似，ERdj5 中的活性位点二硫键非常稳定，该蛋白是首个在哺乳动物内质网中被检测出的二硫键还原酶。ERdj5 可裂解错误折叠蛋白的二硫键，以促进其通过内质网膜的逆转通道。ERdj5 还可将错误折叠的底物转移到Ig 结合蛋白（BiP），BiP 是内质网中主要分子伴侣，它可通过J 结构域中的HPD（Hys-Pro-Asp）基序与ERdj5 结合，并将底物募集到逆转通道以促进其在内质网的相关降解途径。

PDI 作为伴侣分子具有将二硫键引入底物的作用[4]。该分子伴侣作用依赖于PDI 的氧化还原活性。PDI蛋白的a 和a' 域包含规范的CXXC 活性位点，而CXXC 位点中第一个半胱氨酸的低pKa (酸度系数)使该残基参与二硫键形成[5]。从结构上看，PDI 的四个结构域形成U 构型，催化结构域a 和a'位于顶部彼此相对，而结构域b 和b'则处于U 内部的催化结构域之间。U 内部尤其是b 和b'结构域疏水，并且作为肽和底物错误折叠区的主要结合位点。这种疏水区域的存在表明PDI 可充当伴侣分子，抑制错误折叠的蛋白聚集[6]。

3.调控Ero1 氧化途径

如前所述，促使二硫键形成的PDI 蛋白将被还原，因此必须重新被氧化以进行下一次的二硫键交换，而该氧化途径则主要依赖于内质网氧化还原酶-1（endoplasmic reticulum oxidase 1,Ero1）。在哺乳动物和其他脊椎动物中存在两个Ero1 同源物，即存在于所有组织中的Ero1α 和显示出某些组织特异性表达的Ero1β。人体中，Ero1α 通常在所有组织和器官中表达，而Ero1β 则更多表达于分泌量较大的细胞中（如胰腺β 细胞和产生抗体的淋巴细胞），这种组织分布的差异表明它们可能适用于不同PDI 蛋白，如PDIp 是胰腺β 细胞的特异性PDI，其只能特异性的被Ero1β 所氧化，进而促进胰岛素蛋白的折叠和生物活性的形成[7]。

Ero1 也是黄素酶，可利用FAD 作为辅因子将电子从PDI 转移到分子氧，从而在过程中形成过氧化氢。因此，Ero1 活性过高时会导致高浓度的过氧化氢产生，从而影响细胞活力，如人Ero1α 过表达会引起蛋白应激反应[8]。另一方面，机体可通过PDI 及其同源物的反馈调节以保持Ero1 活性的稳定，并维持内质网中氧化还原的平衡[9]，如Ero1 中的调节性二硫键帮助电子在氧化途径的转移，PDI 的过度降低会导致Ero1α 的调节性二硫键断裂来抑制其活性。相反，一旦形成足够的氧化型PDI，将促使调节性二硫键的形成以激活Ero1α 活性[10]。

4.PDI 与Prx4 和GPx7/8 协同消除和利用H2O2

Ero1-PDI 途径产生的H2O2可导致内质网应激的发生，因此，体内需存在能够及时清除多余H2O2的生理活动。目前，在人细胞内质网中已发现三种过氧化物酶可清除过氧化物，分别为过氧化物还原酶4（peroxiredoxin 4,Prx4） 和 谷胱甘肽过氧化物酶7/8（glutathione peroxidases,GPx7/8）。Prx4 和GPx7/8 可以利用H2O2氧化PDI，并且已有研究显示多个PDI 家族成员可直接还原Prx4 和GPx7/8 以回收这三种过氧化物酶,保证其在内质网中的含量。另一方面，PDI 自身也被氧化以便进行下一次的二硫键交换[11,12]。GPx7 和GPx8 能有效代谢Ero1 生成的H2O2，可能是因为它们在空间上位于PDI-Ero1 复合物附近[12，13]，而Prx4 主要利用独立于Ero1 来源的H2O2以氧化PDI 家族蛋白[14]。

二、PDI 家族蛋白在生殖领域中的作用

（一）在男性（雄性）生殖中的作用

1993年有研究首次显示PDI 同工型蛋白在发育精子的顶体中特定定位，并且指出该蛋白可被转运到成熟精子和附睾精子的核中[15]，揭示PDI 家族蛋白在男性生殖过程中存在潜在作用的可能性。随后，有研究使用蛋白质组学分析表明，精子中存在PDI 成员如ERp57，ERp72 及PDIA6 等[16]。

1.ERp57

2006年Ellerman 等证实蛋白质二硫键异构酶的抑制剂能够在体外抑制精卵融合，并且ERp57 在配子融合中起关键性作用[17]。2007年Ellerman 等又揭示ERp57 位于人睾丸生精细胞的细胞质以及人精子顶体和鞭毛中，该蛋白在精子获能过程中被修饰，并再次证实其在配子间融合中的重要作用[18]。2010年，Wiwanitkit 根据生物信息学分析发现ERp57 内有三个翻译后修饰，为明确其缺乏可造成男性不育的分子机制奠定了基础[19]。2012年，Zhao 等确认ERp57 蛋白存在于大鼠精子发生和形成的各个阶段细胞以及Leydig 细胞中，并且ERp57 mRNA 同样在几乎所有大鼠精子发生阶段的细胞中被转录，提示其在精子发生中可能起到的关键性作用[20]。2017年，有关ERp57 在男性生殖中的研究又有了新的突破，Wong 等证明ERp57 是多聚精子-透明带受体复合物（multimeric spermatozoa–zona pellucida receptor complex）的一个组成部分，可通过上调精子表面硫醇含量以调节人类精子和透明带之间的结合[21]。

2.PDILT

除了普遍存在的PDIA3 外，雄性生殖细胞还表达睾丸特异性PDI 样蛋白PDILT。该蛋白仅存在于减数分裂后雄性生殖细胞的内质网中，尽管PDILT 没有共有的CXXC 结构域，且也不是经典的氧化还原酶，但它在体外确实与钙镁蛋白（calmegin,CLGN）和模型蛋白相互作用，这表明它可能在精子蛋白成熟中扮演关键角色，因此其缺失也是男性不育症的重要因素之一[22]。2012年，Tokuhiro 等研究表明PDILT 与睾丸特异性凝集素伴侣（包括calreticulin-3 和Calegegin）协同作用，这三种蛋白形成伴侣复合物，有助于精子生成正确折叠的特异性蛋白，并在ADAM3 的二硫键形成中起着不可或缺的作用，而ADAM3 是一种精子膜蛋白，其对于精子从子宫迁移到输卵管以及精子与透明带结合均至关重要[23]。PDILT 倾向于结合蛋白质底物中暴露的芳香族残基，其b' 结构域与钙网蛋白3(calreticulin-3“CRT3”)P 结构域和Calegein（CMG）之间缺乏相互作用位点，这也提示睾丸特异性凝集素分子伴侣与PDILT 之间存在一种独特的相互作用方式[24]。如前所述，PDILT 是雄性生殖细胞减数分裂后精子发生的特异性蛋白折叠所必需的分子伴侣，但调节该分子伴侣活性的结构机制并不清楚。2018年，Li 等展示了人全长PDILT （hPDILT） 的晶体结构和溶液结构，并分析了hPDILT 的分子伴侣活性，由此提供该蛋白结构基础以帮助了解PDILT 分子伴侣活性的确切机制[25]。

3.PDIA6 和ERp29

2016年，有研究表明PDIA6 和血管紧张素转化酶（ACE）是热休克蛋白A2（HSPA2）的相互作用蛋白，并表明该组装体位于精子头部顶体周围区域的膜筏微区（membrane raft microdomains）中。由于分子伴侣HSPA2在精子获能过程中精子膜表面重塑起关键性作用，并且HSPA2 蛋白表达不足的人精子缺乏识别人卵母细胞的能力。因此，PDIA6/ACE/HSPA2 复合物可能是参与受精级联反应的关键要素。此外，在精子获能过程中，ACE 表达无明显变化，而PDIA6 表达却显著增加，并且这种表达被证明易受氧化应激的影响[26]。2019年，有研究发现使用等渗和低渗溶液活化鳟鱼精子时，精子中PDIA6 的丰度均发生明显的变化，并且在等渗溶液中，PDIA6 是所有被检测出的精子蛋白中唯一丰度增加的蛋白，而其它在低渗溶液中丰度变化的蛋白在等渗溶液中却无明显的改变,其具体机制目前还尚未明确[27]。

2007年，ERp29 在大鼠精子中的存在首次被报道。随着精子在附睾内成熟，精子及其表面和附睾上皮细胞质中ERp29 含量均显著增加[28]。2010年，研究进一步证明了ERp29 在小鼠精子附睾转运和顶体反应期间的精子上存在显著性变化。在附睾头部精子中，ERp29 位于精子头部的前部区域，而在附睾尾部则存在于精子的整个头部和尾部区域。此外，ERp29 在顶体反应后仍存在于精子头部的赤道和顶体后区域，并且证明了ERp29 可能通过促进精卵细胞膜融合而参与精子受精过程[29]。

4.PDIA1

PDIA1 是PDI 蛋白家族在内质网中丰度最高，且介导氧化还原功能的成员，其表达受三碘甲状腺素（triiodothyronine，T3） 和雌激素的调节。尽管PDIA1 在附睾精子成熟中的作用仍未知，但PDIA1 作为雌激素活性调节剂的潜在功能可解释其在附睾中的表达作用[30]。2016年，Schorr-Lenz 等证实，在抗促性腺激素释放激素（GnRH）免疫后，附睾中PDIA1 和PDIA3 的表达均发生了改变，提示附睾中的PDI 表达受内分泌因素影响[31]。2020年，研究发现PDIA1 存在于年轻种马的附睾液和精子中，其含量比从24月以下幼马的附睾液中检测到的含量增加了三倍。成年种马精液中也能检测到PDIA1，但其含量与生育力无关[32]。此外，由于雌激素的生物合成不仅发生在睾丸中，也在附睾上皮中继续进行，因此，PDIA1 在马附睾液和精子中的存在可能与精子发生和成熟过程的雌激素依赖性有关。

（二）在女性（雌性）生殖中的作用

目前，已有研究报道部分动物的PDI 家族蛋白与女性（雌性）生殖相关，如2013年有研究显示PDI 在家猪卵母细胞中的分布[33]。在鼠类，2011年Rosewell 等研究证明ERp57 和丝氨酸蛋白酶受到基质金属蛋白酶2/9（MMP2/9）的调控，而MMP 家族被认为在排卵过程中起重要作用[34]。2014年，Liu 等发现ERp57 在减数分裂I（MI）和减数分裂II（MII）中急剧增加，并可能在精卵融合中扮演了重要的角色[35]。2012年，有研究发现相比于体内成熟的MII 卵母细胞，体外成熟的MII 卵母细胞中PDIA6 表达显著下调[36]。2019年Li 等人发现在体外使用200ng/ml 生长激素（GH）培养的人卵母细胞中PDIA6 表达比对照组高2.5 倍，因此，PDIA6 在GH组中的高表达表明GH 的添加可为平衡卵母细胞氧化还原稳态提供更好的培养环境[37]。

（三）在胚胎发育中的作用

迄今为止，虽然PDI 在女性（雌性）生殖中作用的研究较少, 但仍发现一些与胚胎相关的研究报道，如2017年有研究首次鉴定出胎盘中存在PDIA4，并显示IL-11 可调节孕期1-3月的人胎盘绒毛外植体和滋养层细胞中PDIA4 蛋白水平[38]。2014年又有研究指出，植入前因子（preimplantation factor,PIF）通过特异性结合位点与PDI 和热休克蛋白（HSP）结合，并在防止胚胎内氧化应激和功能性蛋白错误折叠过程中起关键作用[39]。2017年Goodale 等的研究进一步证明PDI 是PIF 在胚胎中的主要靶标，PIF 可使其成为重要的ROS 清除剂，并且加入PDI 抑制剂16F16 可显著减缓胚泡发育过程[40]。

三、结语

蛋白质二硫键异构酶家族对于细胞内质网中蛋白折叠及二硫键形成、还原和异构等是不可或缺的蛋白，并且对其结构、功能以及在不同医学领域，尤其是在生殖医学领域中的研究意义重大。目前，对于PDI 家族蛋白在生殖中的研究尚处于初步阶段，在女性生殖领域的研究也较为欠缺。因此，在未来逐渐阐明PDI 家族蛋白在整个生殖过程中的作用机制将有助于为临床上不孕不育症等相关疾病的诊断与治疗提供新的思路以及潜在的靶点。