石墨烯基材料在毛细管电泳中的应用进展

徐 蕾，卢 静，崔凤娟，高立娣

(齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

石墨烯(Graphene)是由sp2杂化的碳原子以六边形排布形成的蜂窝状二维新型碳材料，是构筑碳的其它同素异形体的基本结构单元[1]，具有大的比表面积、优异的导电性、良好的稳定性和高的机械强度。但是，石墨烯极易团聚，较强的π-π电子共轭作用导致其疏水性较强，因此直接应用受到限制。氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)是高结晶性的石墨烯强力氧化后的产物，具有二维层状结构，片层结构间存在羟基和环氧基团，边缘也存在羧基，此结构使之具有亲水性并提供了反应活性基团，扩展了应用范畴。还原氧化石墨烯(Reduced graphene oxide，GOOH)是广义上的石墨烯材料,由于经历了氧化和还原步骤，GOOH表面存在缺陷，利于修饰。石墨烯量子点(Graphene quantum dots,GQDs)，是石墨烯家族中冉冉升起的一颗新星。GQDs是指尺寸小于100 nm的石墨烯片层[2]，厚度为0.5～1.0 nm，它结合了石墨烯和量子点的优良性质，表面有含氧基团，具有良好的水溶性并易于功能化。上述石墨烯基碳材料，在光电、催化、传感、清洁能源和生物医药等方面具有良好的应用前景[3-4]。

毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)是经典电泳与现代微柱分离技术完美结合的产物，具有高效、快速、微量、易于自动化等特点。石墨烯基材料具有大的比表面积，利于分离，当用作色谱或毛细管电色谱(Capillary electrochromatography,CEC)的固定相时，可提供与分析物附加的相互作用位点从而改善分离[5]。而且，在GO或GOOH表面可共价键合某些官能团进行改性，使之具有更高的选择性和生物兼容性。在CE中，石墨烯基材料可以直接加入到背景电解质(BGE)中作为假固定相；也可以被吸附或键合到CEC柱的固定相上形成半永久或永久涂层。本文主要综述了近年来(2013～2018年)石墨烯基材料在CE中的应用并进行了展望。

图1 石墨烯基固定相在CEC中的选择和保留机理Fig.1 A general scheme of selectivity and retention mechanisms of graphene-based stationary phases in CEC

图2 3个多环芳烃(A)和3个芳香族化合物(B)在裸NH2-SiO2、GO@SiO2和G@SiO2填充柱上的电泳图 [8]Fig.2 Electrochromatographic separations of three polycyclic aromatic hydrocarbons(A) and three aromatic compounds(B) on bare aminosilica,GO@SiO2 and G@SiO2 packed columns[8]inset is optical and SEM images of packed beds in capillaries using packing slurries containing GO@SiO2 microspheres

1 背景缓冲液的添加剂

2 CEC的固定相

CEC是一种结合了CE的高分离能力和高效液相色谱(HPLC)的高选择性的微分离技术。根据固定相在毛细管内存在形式的不同，可划分为填充柱-CEC、开管柱-CEC及整体柱-CEC。图1为石墨烯基固定相材料在CEC中的选择和保留机理。

2.1 填充柱-CEC

毛细管填充柱通过将色谱填料填充到毛细管内，采用电渗流(EOF)或EOF结合压力流驱动流动相，进而实现样品分离。石墨烯基材料用于填充柱-CEC的报道极少，主要是因为将纳米厚度的石墨烯或GO填充到毛细管柱内比较困难，且团聚的石墨烯片没有足够的机械强度抵抗填充产生的高压力；同时，石墨烯不规则的形貌会降低分离效率。Wang等[8]利用氨基功能化的SiO2纳米粒子与GO间的缩合反应制备了SiO2微球功能化的GO复合材料(GO@SiO2)，并以水合肼为还原剂制得SiO2功能化的石墨烯复合材料(G@SiO2)，然后利用压力匀浆填充法将SiO2、G@SiO2和GO@SiO23种单颗粒料填充到毛细管内制成填充柱，对3种弱极性多环芳烃及3种极性不同的芳香族化合物进行了分离(见图2)。结果表明：G@SiO2和GO@SiO2同目标物间存在独立或协同的π-π堆积及氢键相互作用。这种填充柱具有很好的重现性，并成功应用于淡水中芳族烃的分析。

2.2 开管柱-CEC

开管柱是指毛细管内壁涂覆或键合有固定相的空心柱。其制备简单方便，但由于柱内修饰的固定相量有限导致样品容量较小，因此会一定程度地影响分离效率。寻找新的固定相材料提高柱的表面积，增强固定相/流动相间相互作用以提高分离度是目前研究的主要方向。GO含有大量的含氧基团，因此容易被键合至氨基功能化的毛细管柱内。Qu等[9]首次利用化学键合法制备了石墨烯/GO修饰毛细管柱(G/GO@column)：以3-氨丙基二乙氧基甲基硅烷为偶联剂，键合GO得到GO@column；并以水合肼为还原剂制得G@column。研究发现：G@column的EOF与pH值(pH 3.0～9.0)密切相关，而GO@column则表现出恒定的EOF；GO@column对中性多环芳烃表现出较好的分离性能，G@column则由于分析物与石墨烯间较强的亲和力产生峰拖尾，分离效果较差。石墨烯的特异性保留对吸附更有利，而GO与蛋白质间较弱的相互作用更利于分离。GO在毛细管柱内的高覆盖率可提高相比，采用化学键合法则可使柱子具备较高的稳定性。这种开管柱已成功用于鸡蛋蛋白中6种蛋白质的分析，展现了石墨烯基材料在CEC分离中的巨大潜力。后续的有关研究，多采用硅烷偶联剂对毛细管进行氨基功能化，进而将GO键合，基于传统的反相分离模式即GO与目标物间的π-π堆积、疏水和氢键等相互作用实现分离[10-17]。Ji等[18]将GO键合至氢氧化铵衍生化的触须式聚合物链(甲基丙烯酸酯缩水甘油酯，GMA)接枝毛细管上，制成开管柱。GMA的触须式结构能延长GO与毛细管内壁的距离，因此可提高GO在柱内的容量和结合力，从而提高相比。这种开管柱在pH 4.0～9.0范围内能形成强且稳定的EOF，用于分离中性小分子时，分离度超过2.30，柱效达到170 000塔板/米。

化学键合法制备的开管柱寿命长，但制备过程复杂耗时，而且在共价涂层中常用的硅烷偶联剂毒性强，对湿度敏感。聚电解质的物理吸附被认为是一种快速产生稳定涂层的方法[19]。石墨烯基材料在水溶液中带负电，因此可通过静电相互作用将其自组装到阳离子聚电解质表面，这种方法稳定性好，制备步骤简单省时。Yang[20]、Wang[21]和Qu[22]等利用石墨烯、GO、GOOH和阳离子聚电解质聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)间的静电引力，通过层层自组装(LBL)制备了石墨烯/GO/GOOH-PDDA修饰毛细管柱，获得了较好的重现性和稳定性。但静电相互作用的稳定性不如化学键，而且涂层在CEC运行中会面临流动相流动产生的持续压力和电泳分离高压，使柱的稳定性下降。Chen等[23]开发了一种共价键合和非共价键合联用的LBL技术(图3)，首先在毛细管内壁键合聚苯胺(PANI)；然后利用分子间聚合作用在PANI表面形成聚多巴胺(PDA)层；最后将GO组装到PDA表面。其中，PANI在多巴胺(DA)的自偶联过程中可促进电子转移从而提高PDA的修饰效果，同时还能增大毛细管的内表面积；以PANI为涂层子层，分离度、理论塔板数、保留因子和对称因子都得到显著提升。该柱的分离性能优于GO键合的开管柱，而且能保持可控的EOF，稳定性高。Yu等[24]开发了一种共价键合的自组装技术制备固定相，以光敏重氮树脂(DR)替代硅烷偶联剂，分别制备了DR/羧基功能化的C60(C60-COOH)和DR/GO涂层。由于DR独特的光化学性质，其与C60-COOH或GO间的离子键经紫外灯处理后可转变为共价键。同裸柱、非共价键合柱相比，共价键合柱分离性能最好。这种绿色、简单的制柱方法为CEC固定相的制备提供了一种新思路。

图3 GO-PDA-PANI@毛细管的制备示意图[23]Fig.3 Schematic procedure of preparing GO-PDA-PANI@capillary[23]

表1对石墨烯基材料用于毛细管开管柱的制备研究进行了总结。研究表明将石墨烯基材料引入到毛细管开管柱的制备可有效提高CE的分离效率和选择性。

表1 石墨烯基材料作为固定相在开管柱-CEC中的应用Table 1 Application of graphene-based materials as stationary phase of open-tubular CEC

2.3 整体柱-CEC

整体柱是在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。相比常规装填的色谱柱，具有更好的多孔性、渗透性及稳定性。有机聚合物整体柱的应用最广泛，其大孔结构可实现生物大分子的快速分离；但由于缺少足量的相互作用位点和介孔，在分离小分子化合物时存在困难。提高柱的表面积是最有效的解决方式，如使用石墨烯基材料对聚合物整体柱进行改性。常用的两种改性制备方法是：(1)一步室温聚合法，在共聚合作用中将石墨烯材料引入整体柱中；(2)后期改性法，在聚合反应后将石墨烯材料修饰到孔表面。一步法在不影响分离效率的前提下可减少制备步骤，缩短制备时间。石墨烯基材料在毛细管整体柱制备中的应用见表2。

表2 石墨烯基材料在整体柱-CEC中的应用Table 2 Application of graphene-based materials in monolithic-column CEC

MAA:methacrylic acid;EDMA:ethylene glycol dimethacrylate;GMA:glycidyl methacrylate

图4 待测中性化合物在poly MAA-EDMA整体柱(A)和poly GO-MAA-EDMA整体柱(B)上的电泳图[25]Fig.4 Electrochromatograms for the separation of test neutral compounds on poly MAA-EDMA monolith(A) and poly GO-MAA-EDMA monolith(B) [25] peak identity:0.thiourea;1.benzene;2.toluene;3.ethylbenzene;4.isopropylbenzene;5.naphthalene;6.acenaphthene;7.fluorene;8.anthracene

Yan等[25]首次利用一步室温聚合法制备了GO-聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(Poly GO-MAA-EDMA)整体柱，与未修饰GO的整体柱相比，该柱对中性目标物的保留时间和保留因子显著提高(图4)，这主要是因为GO与固定相、分析物间较强的疏水和π-π静电堆积相互作用，不仅能改善分离，还提高了整体柱的机械稳定性。之后，研究人员使用不同的单体，利用一步聚合法制备了GO改性的各种聚合物整体柱[26-31]，这些整体柱均表现出较好的稳定性，不仅可用于极性/非极性化合物的分析，还可用于微萃取技术对分析物进行富集。

尽管一步法制备简便，但一旦更换功能单体，聚合物的组成和反应条件都需重新优化。为了避免复杂的优化步骤，使用后期改性法是一个不错的选择。Jia等[32]利用三步原位共聚法——首先基于柱内甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和乙二醇二甲基丙烯酸(EDMA)的原位共聚合制得聚(GMA-EDMA)整体柱，然后基于氨基和羧基的缩合作用将乙二胺接枝到整体柱上，最后再键合GO，得到GO@poly(GMA-EDMA)整体柱。该整体柱可作为萃取材料与HPLC结合对前列腺癌细胞中的肌氨酸进行分析。

整体柱的分离能力与聚合物的孔结构密切相关，而制孔剂的种类和组成是影响孔结构的最直接因素。大部分整体柱的制备多使用N,N-二甲基甲酰胺、甲苯、醇等有机试剂为制孔剂，这类物质易挥发且有毒性。Huang等[33]以室温离子液体(RTILs)1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和深共熔溶剂(DESs)氯化胆碱-1,2-丙三醇为二元绿色制孔剂，制备了一种GO掺杂的整体柱。这种制孔剂充分结合了RTILs和DESs的优势，功能化的GO在此溶剂中有较好的分散性，进而使整体柱表现出良好的渗透性和均匀性。以小分子烷基苯为目标物对该整体柱的分离性能进行评价，最大柱效可达147 000塔板/米。

3 CE-电化学/电化学发光检测电极的修饰材料

电化学(EC)和电化学发光(ECL)法仪器简单、价格低廉，是CE常用的检测技术[34-35]。工作电极是这两种方法中最重要的部分。使用化学修饰电极可以有效降低分析物的过电位，提高灵敏度和选择性，因而成为CE-EC/ECL研究中的一个热点。

图5 5种糖在石墨烯-Co纳米微球杂化糊电极(A)和石墨-Co杂化糊电极(B)上的电泳图 [46]Fig.5 Electropherograms for a mixture containing mannitol(a),sucrose(b)，lactose(c),glucose(d) and fructose(e)(0.25 μmol/L each) at a graphene-CoMS hybrid paste electrode (A)and a graphite-Co hybrid paste electrode(B)[46]inset：microscopic photograph of a piece of graphene-CoMS hybrid paste electrode

复旦大学陈刚课题组在CE-EC中石墨烯基材料修饰电极的制备方面做了一系列卓有成效的工作。他们基于石墨烯和阴离子交换树脂间的静电相互作用和后续的化学还原法，制备了石墨烯包裹的阴离子交换树脂球，将其嵌入聚丙烯移液管中制成石墨烯球电极，并用于CE-EC中对洗衣液中的杀菌防腐剂进行分离检测[36]。并利用熔融石英毛细管微通道中石墨烯和聚合物的原位缩聚作用，制备了一系列石墨烯/聚合物复合电极，作为CE的安培检测器[37-42]。这些电极制备简单，电催化活性高，表面抗污染能力强，稳定性高。他们还制备了几种石墨烯-金属纳米粒子杂化复合物糊电极[43-46]，用于食品中几种糖的分析，5种糖在石墨烯-Co纳米微球杂化糊电极[46](图5A)上的电化学响应比石墨-Co杂化糊电极(图5B)高得多。Chen等[47-48]在电极表面利用一步电化学还原GO制备了GOOH修饰的碳纤维微盘电极，并用于CE-EC对眼药水、单HepG2细胞中的谷胱甘肽和人全血提取物中的色氨酸、尿酸和谷胱甘肽进行了分析。

石墨烯基材料也可用于制备芯片CE-EC的工作电极。Escarpa等[49]制备了杂化聚合物/石墨烯修饰的碳丝网印刷电极，用于芯片CE中对D-甲硫氨酸和D-亮氨酸进行了分离。Ferreira等[50]直接在商用芯片CE仪的铂工作电极上电解还原GO，得到石墨烯修饰电极，该电极表现出较高的表面电导性和电化学响应，可分离检测两种阴离子混合物碘化物和抗坏血酸。表3总结了石墨烯基材料作为CE-EC检测电极的修饰材料进行的相关应用。

表3 石墨烯基材料修饰电极在CE-EC检测中的应用Table 3 Application of graphene-based materials modified electrode in CE-EC detection

(续表3)

ElectrodeModified nanomaterialElectrodic substrateDetection potentialElectrophoretic conditionsCapillary(Id,length)Running bufferSeparation voltage and injectionAnalyteRefGraphene/poly(ethyl 2-cyanoacrylate) composite electrode0.8 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,50 cm50 mmol/L borate buffer(pH 9.2)12 kV;12 kV,6 sResorcinol,rutin,hyperoside,chlo-rogenic acid,and quercetin[41]Graphene/poly(ethylene-co-vinyl acetate) composite electrode0.8 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,50 cm50 mmol/L borate buffer(pH 9.2)12 kV;12 kV,6 sRutin,quercitrin,kaempferol,and quercetin[42]Graphene-phenolic resin composite electrode0.8 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,40 cm50 mmol/L borate buffer(pH 9.2)15 kV;15 kV,6 sIsoferulic acid,ferulic acid and caffeic acid43Graphene-Cu NP composite paste electrodes0.65 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,40 cm75 mmol/L NaOH12 kV;12 kV,6 sMannitol,su-crose,lactose and glucose[44]Graphene-Ni NP composite microsphere electrodeand0.65 V(vs.SCE)25 μm,40 cm75 mmol/L NaOH12 kV;12 kV,6 sSucrose,glucose and fruc-tose[45]Graphene-cobalt microsphere hybrid paste electrodes0.65 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,40 cm75 mmol/L NaOH12 kV;12 kV,6 sMannitol,su-crose,lactose,glucose and fruc-tose[46]Reduced graphene oxideCarbon fiber microdisk electrode0.8 V(vs.SCE)25 μm,37 cm25 mmol/L PBS(pH 7.4)16 kV;5 kV,10 sDopamine,epineph-rine,L-cysteine,glutathione,ascor-bic acid,uric acid[47]Reduced graphene oxideCarbon fiber microdisk electrode0.9 V(vs.SCE)25 μm,37 cm25 mmol/L PBS(pH 7.4)18 kV;5 kV,10 sTryptophan,glu-tathione and uric acid[48]

4 CE样品前处理技术中的吸附剂

虽然CE具备许多优点，但在光学检测中由于进样量小导致检测光程变短从而使灵敏度较低。为了解决这一问题，可采取一些离线预富集技术。石墨烯的比表面积大，含有丰富的π电子体系，可与芳环化合物及含π电子的化合物相互作用，而且吸附位点多。石墨烯基材料作为良好的吸附剂已成功用于固相萃取(SPE)[55]、磁性固相萃取(MSPE)[56]和固相微萃取(SPME)[57]，其中，与HPLC和气相色谱联用的报道较多，在CE中的报道还比较少。

SPE是目前应用最广泛的一种样品前处理技术，主要是基于分析物和柱填料间的亲和力实现萃取。Ye等[58-59]以石墨烯为SPE的吸附剂材料，分别对美容产品中的4种对羟基苯甲酸酯类防腐剂和肉中4种磺胺残留进行了萃取，然后利用CE-二极管阵列法进行了分离检测。实验考察了洗脱剂种类、体积、样品pH值、上样流速等影响因素，获得了满意的回收率。GO含有大量的亲水基团，对这些基团进行选择性修饰可以实现对不同分析物的选择性吸附。Jia等[60]以3-氨基苯硼酸功能化的GO为SPE的新型吸附剂，对4种核苷进行了选择性富集，然后结合CE建立了中药制剂中核苷的分析方法，该方法简单、灵敏、重现性好。

MSPE是依托磁性或可被磁化的材质充当吸附剂的一类分散SPE技术。与 SPE 填料相比，磁性颗粒的体积小，相对面积大，分散快，具有非常高的萃取能力和萃取效率；同时借助磁性完成分离，操作简单方便。王卫平等[61]以水热法合成的磁性石墨烯吸附剂对三嗪类除草剂有较好的特异性吸附效果，主要是因为分析物的三嗪环同GO含有的苯环可形成强π-π共轭作用，其氨基还能与GO中的羟基、羧基等形成较强的氢键，从而进一步提高吸附性能。该萃取方法与CE结合可对环境水样中的三嗪类农药和牛奶中的磺胺[62]进行分析。董树清等[63]通过一步化学共沉淀法制备了GQDs包裹的Fe3O4磁性纳米复合材料，对肉桂酸及其衍生物进行了萃取。Hamidi等[64]则分别以一步聚合法和共沉淀法合成了GO/PDA、磁性石墨烯/Fe3O4复合材料，并以之作为分散SPME的吸附剂，结合CE建立了人血浆中维拉帕米的测定方法。这种萃取技术仅需500 μL丙酮洗脱剂，大大减少了有毒、非水溶性试剂的使用，对维拉帕米检测的线性范围为5～500 ng/mL。Fakhari等[65]首次将基于GO的SPE-电膜萃取联用技术与CE结合分析了多种氯苯氧基酸除草剂，在最佳条件下富集因子可达1 950～2 000，检出限低至ng/L数量级，这种双萃取技术操作简单、价格低廉、富集效率高，样品清洁环保。

5 结论与展望

本文总结了石墨烯基材料近年来在CE样品前处理、分离、检测方面的研究进展。各种新型功能化石墨烯基材料的不断出现使其在色谱领域得到持续进步和发展，但是应用于CE中仍然存在一些问题：如石墨烯基材料用于制备CEC固定相时，研究多集中在对标准品的分析上，缺少对真实样品的分析；石墨烯悬浮液的稳定性直接影响粒子大小、表面电荷密度和分散介质的离子强度从而影响分离效果；GQDs在CE中的应用研究很少；此外，缺少对石墨烯基材料在样品前处理及CE分离中相关机理的深入研究。

为了使CE具备更高的分离效率、选择性、样品富集性能和更合适有效的检测体系，未来石墨烯基材料在CE中的研究将集中在以下几个方面：(1)设计和合成功能化的石墨烯基材料，使其具备选择性更高的相互作用位点、更快的电子转移速度和更大的样品负载量；(2)合成具有更多应用特性的新型功能化石墨烯纳米复合材料；(3)对石墨烯基材料在CE分离机理方面开展更深入的研究；(4)拓宽石墨烯基材料在芯片CE领域中的应用。我们也期待石墨烯及其功能化复合材料在CE领域发挥更重要的作用。