超快速液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱法同时测定连翘药材中的多元活性成分

魏丽芳，梅余琪，邹立思，刘训红，陈佳丽，谈梦霞，王程成，蔡芷辰，林丽群

(南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023)

连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的干燥果实，收载于2015年版《中国药典》，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效，用于治疗痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒等症[1]。研究表明，连翘主要含有苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类及酚酸类等多元活性成分[2]。其中，苯乙醇苷类成分具有抗菌[3]、抗炎[4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]、抗内毒素[7]及保肝[8]等作用；木脂素类成分具有抗炎[9]、抗病毒[10]、抗氧化[11]及保肝[12]等作用；黄酮类和酚酸类成分具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等作用[13-16]。中药疗效的发挥是多种活性成分协同作用的结果，建立连翘中多种药效成分同时测定的方法，对于探讨多指标成分的综合评价体系具有实用性和有效性。

目前，关于连翘药材的质量评价研究多以少数几个活性成分含量为评价指标，尚少见对多元活性成分同时测定的研究报道。2015年版《中国药典》以连翘酯苷A和连翘苷为质控指标，然而，单一或少数几个活性成分的含量难以客观反映中药的整体质量[17]。文献报道的连翘药材中成分分析的方法有高效液相色谱法(HPLC)[18-19]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[20-21]等。但上述方法仅测定连翘药材中含量较高的几个成分，较难客观反映连翘药材的整体质量。HPLC法难以有效分离极性相似的组分，且存在分析时间长、灵敏度低等缺点，不能很好地满足检测需求[22]。三重四极杆/线性离子阱质谱(QTRAP-MS/MS)兼具三重四极杆质谱的多种扫描功能以及线性离子阱质谱的多级质谱打碎能力，其多反应监测模式(MRM)可根据分子量和碎片质量的不同使色谱行为相似的物质得到完全分离，并可同时进行多个化合物的定量分析，大大缩短了分析时间[23]。此外，线性离子阱可将离子聚焦于一条线上，与三维离子阱相比，增加了离子的存储量，使仪器灵敏度得到提高[24]。因此，LC-QTRAP-MS/MS具有高选择性、高通量、高灵敏度的特点，适合于中药等复杂体系的组分分离分析。

本实验采用响应面法优化了连翘药材提取条件，基于超快速液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱(UFLC-QTRAP-MS/MS)技术，建立了同时测定连翘中苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类及酚酸类共21种活性成分含量的方法。该方法可在较短时间内实现多种成分的分离分析，使同分异构体达到基线分离，有效提高了检测通量和检测速度，且能够检测药材中的痕量和超痕量组分，可为连翘药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-MS系统：Shimadzu SIL-20A XR 超快速液相色谱仪，包括LC-20AD二元输液泵、STL-20A XR自动进样器、CTO-20AC柱温箱(日本岛津公司)；AB QTRAP 5500 三重四极杆/线性离子阱质谱仪，配有电喷雾离子源和Analyst 1.5.2软件(美国AB SCIEX 公司)。 Q-500B高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)；BSA224S型电子分析天平(感量万分之一)、ME36S型电子分析天平(感量百万分之一)购于德国赛多利斯公司；湘仪H1650-W高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；KQ-500B超声波清洗机(超声功率500 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)。

对照品：连翘酯苷A(批号lw18012502，下同)、连翘酯苷B(lw180210050)、连翘苷(lw18012210)、松脂醇(lw171207150)购自南京良纬生物技术有限公司；连翘酯苷I(S23N7D25441)、牛蒡子苷(R12O8F45507)、对香豆酸(15S4)、阿魏酸(H27J7L16718)、橙皮苷(P06D9F77001)、木犀草素(C24M8Q36543)、连翘脂素(Z04J9X62808)购自上海源叶生物技术有限公司；松脂醇-β-D-葡萄糖苷(151205)购自成都克洛玛生物科技有限公司；芦丁(0080-9705)、没食子酸(110831-200302)、黄芩苷(110715-200514)、紫云英苷(11092001)购自中国药品生物制品检定所；槲皮素(100081-201509)、木犀草苷(111720-201408)、咖啡酸(110885-200102)、山奈酚(110861-201310)购自中国食品药品检定研究院；绿原酸(20160701)购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；经HPLC测定，上述化合物的纯度均大于98%。实验用水为Milli-Q超纯水；甲醇、甲酸、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

连翘原药材实地采集于国内主产区，商品药材购自药材公司，均经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为木犀科(Oleaceae)植物连翘Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的干燥果实。样品信息见表1。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

表1 连翘药材样品信息Table 1 The sample information of Forsythiae Fructus

1.2 溶液的制备

1.2.1 对照品溶液的制备精密称取各对照品适量，加72%甲醇配制成对照品贮备液，没食子酸、绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷B、连翘酯苷I、芦丁、对香豆酸、连翘酯苷A、木犀草苷、阿魏酸、松脂醇-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、橙皮苷、黄芩苷、连翘苷、牛蒡子苷、木犀草素、山奈酚、松脂醇和连翘脂素的质量浓度分别为985、1 000、990、1 075、985、990、2 018、5 060、1 000、1 235、1 100、1 170、1 885、976、1 015、1 025、985、1 004、1 006、1 180、990 μg/mL。取各对照品贮备液适量，加72%甲醇定容至5 mL配成混合对照品溶液，并逐级稀释，得到一系列不同质量浓度的工作溶液，以0.22 μm微孔滤膜过滤，置于4 ℃ 冰箱保存，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备取过50目筛的连翘果实粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入19 mL 72%甲醇，密闭，称定质量，超声提取60 min(功率500 W，频率40 kHz)，放冷至室温，再次称定质量，用72%甲醇补足失重，过滤。滤液以12 000 r/min离心10 min，取上清液稀释10倍，以0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：XBridge ® C18色谱柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流动相：A为水(含0.1%甲酸)，B为乙腈；梯度洗脱：0～0.01 min，2% B；0.01～6.5 min，2%～23% B；6.5～10.0 min，23%～24% B；10.0～14.0 min，24%～45% B；14.0～16.0 min，45%～55% B；16.0～17.0 min，55%～2% B；柱温为30 ℃；流速为0.8 mL/min；进样量为2 μL。

1.3.2 质谱条件电喷雾离子化源(ESI)；多反应监测模式(MRM)检测；离子源温度(TEM)：550 ℃；喷雾电压(IS)：正离子模式下为4 500 V，负离子模式下为-4 500 V；气帘气(CUR)流速：40 L/min；雾化气(GS1)流速：55 L/min；辅助气(GS2)流速：55 L/min；接口加热，全程通入氮气。

2 结果与讨论

2.1 供试品制备方法的优化

2.1.1 单因素优化实验由于提取溶剂、液料比及提取时间会对药材的提取效率造成影响，实验采用液相色谱法对药典指标成分连翘酯苷A和连翘苷的含量进行检测，以其提取率作为响应值，对提取溶剂(30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、100%甲醇)、液料比(20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g)及提取时间(15、30、45、60 min)进行了单因素考察(见图1)。结果表明，当甲醇的体积分数为30%～70%时，连翘酯苷A、连翘苷的提取率及总提取率均随着甲醇体积分数的增大呈上升趋势，继续增大甲醇体积分数，提取率反而下降。料液比及提取时间对提取率的影响均为随着因素水平的增大而增大，但料液比达到35∶1 mL/g、提取时间达到45 min后，三者的提取率增速较慢。综合考虑溶剂消耗和提取率，选择70%甲醇作提取溶剂、液料比为35∶1 mL/g，超声提取45 min。

图1 甲醇体积分数(A)、液料比(B)及提取时间(C)对连翘脂苷A、连翘苷提取率的影响Fig.1 Effects of methanol volume fraction(A)，liquid to material ratio(B) and extraction time(C) on extraction rates of forsythiaside A and phillyrinphillyrin;forsythiaside A;total

2.1.2 响应面实验设计与模型建立根据单因素实验结果，以甲醇体积分数(A)、液料比(B)和提取时间(C)为考察因素，应用Box-Behnken中心组合方法[25]进行三因素三水平的实验设计，以连翘酯苷A和连翘苷的提取率总和(Y)为响应值，进行响应面分析。实验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

应用Design-Expert 8.0.6 对表2数据进行多元线性回归和二项式拟合，得多元线性回归方程为Y=-31.153+0.402A+1.428B+0.034C-2.625×10-3AB-6.167×10-4AC+1.267×10-3BC-1.863×10-3A2-0.017B2-2.122×10-4C2。

对该模型进行回归方差分析和显著性检验(表3)。结果表明，该模型F值为30.42(P<0.000 1，模型极显著)，而失拟项的F值为2.38(P=0.210 8>0.05，不显著)，表明该方程的拟合较好且具有统计学意义。各考察因素对响应值影响的程度为A>B>C，总体上因素A、B、C、A2、B2以及交互项AB均显著影响连翘酯苷A和连翘苷的提取率。

表3 响应曲面方差分析及显著性检验Table 3 Variance analysis and significant test for response surface

**P≤0.01 is extremely significant;*P≤0.05 is significant

根据回归方程绘制不同影响因素对连翘酯苷A和连翘苷总提取率的响应曲面图，结果见图2。由图2可知，甲醇体积分数与液料比的响应曲面较陡，表示其交互作用对连翘酯苷A和连翘苷提取率的影响显著，而甲醇体积分数与提取时间、液料比与提取时间的响应曲面较平滑，影响较小，与表3方差分析结果一致。

图2 各因素间交互作用对连翘酯苷A及连翘苷提取率的响应曲面图Fig.2 Response surface diagram of interaction between various factors on extraction efficiencies of forsythiaside A and phillyrin

2.1.3 模型验证利用Design-Expert 8.0.6对回归方程进行求解，得到最优的提取条件：甲醇体积分数为71.24%，液料比为37.81∶1 mL/g，提取时间为60 min，提取率预测值为11.53%。为便于实验操作，将上述条件修正为甲醇体积分数72%，液料比38∶1 mL/g，提取时间60 min。在此条件下进行3次平行实验，得平均提取率为11.41%，与理论值的相对误差为1.04%，说明该提取条件参数可靠，因此选其作为连翘药材的提取条件。

2.2 色谱-质谱条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化比较了SynergiTMHydro-RP 100Å柱(2.0 mm×100 mm，2.5 μm)和XBridge®C18柱(4.6 mm× 100 mm，3.5 μm)对21种目标成分的分离效果，结果发现两柱对目标化合物的分离效果差别不大，但后者所得色谱响应略高且色谱峰形更对称，因此选择XBridge ® C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)作为分离柱。分别考察了水-甲醇、水-乙腈、水(含0.1%甲酸)-乙腈组成的流动相体系对21种目标化合物色谱行为的影响。结果表明，以水(含0.1%甲酸)-乙腈为流动相时，21种目标物能获得较好的色谱峰形、分离效果和检测灵敏度。因此，选择水(含0.1%甲酸)-乙腈作为流动相。

2.2.2 质谱条件的优化分别将质量浓度为100 ng/mL(连翘酯苷I、连翘酯苷A、连翘脂素为1 μg/mL)的目标化合物标准溶液注入离子源中，在正离子和负离子模式下进行全扫描。结果显示，紫云英苷、连翘苷、牛蒡子苷在正离子模式下有较强的离子响应，其他成分在负离子模式下的响应值更高。进而对分子离子峰进行二级质谱扫描(子离子扫描)，得到离子碎片信息和二级质谱图,然后对解簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等参数进行优化，使分子离子和特征碎片离子对的强度达到最佳。优化得到的质谱参数见表4，MRM色谱图见图3。

表4 21种目标成分的质谱分析参数Table 4 MS/MS parameters of 21 constituents

图3 21种目标成分混合对照溶液的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograms of 21 constituents in reference solutionthe peak numbers denoted were the same as those in Table 4

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、检出限与定量下限精密吸取“1.2.1”中系列浓度的对照品溶液及混合对照品溶液各2 μL，按“1.3”色谱-质谱条件进行分析。以对照品的质量浓度(X，ng/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并以最小二乘法进行线性回归。分别以信噪比S/N≈3和S/N≈10时各对照品的质量浓度作为检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表5。结果显示，21种目标成分在一定质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数(r)不小于0.999 0，检出限为0.001～233.710 ng/mL，定量下限为0.002～771.250 ng/mL。

2.3.2 精密度、重复性与稳定性精密吸取同一混合对照品溶液(各成分质量浓度约为10 μg/mL)2 μL，在1天内连续进样 分析6 次，计算得21种目标成分日内峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.2%～4.0%；每天进样3针，连续3天进样分析，计算得日间峰面积的RSD为2.8%～4.0%(表6)，说明仪器精密度良好；取同一连翘样品6份，每份0.5 g，精密称定，分别按“1.2.2”制备供试品溶液，进样分析，计算得21种目标成分峰面积的RSD为1.4%～4.0%(表6)，表明该方法重复性良好；取同一连翘供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样分析，计算得21种目标成分峰面积的RSD为1.8%～4.0%(表6)，表明供试品溶液在24 h内具有较好的稳定性。

表5 21种化合物的线性关系、检出限和定量下限Table 5 Linear relations,limits of detection and limits of quantitation of 21 constituents

2.3.3 加标回收率取已测知含量的连翘样品0.25 g(各9份)，精密称定，分别加入低、中、高3个水平(80%、100%、120%)的对照品适量，每个水平3份，按“1.2.2”制备加标回收供试品溶液，并按本方法进行测定，得到21种目标成分的平均回收率为98.6%～102%，RSD为0.89%～3.8%(表6)。结果表明该方法的准确度良好，符合定量分析要求。

表6 精密度、重复性、稳定性及加标回收率结果(%)Table 6 Precisions,repeatabilities,stabilities and recoveries of 21 constituents(%)

2.4 样品含量的测定

将表1中的样品按“1.2.2”制成供试品溶液，取2 μL按本方法进行测定，根据相应的线性关系计算供试品溶液中21种目标成分的含量，结果见表7、图4。结果表明，所分析的连翘样品中，连翘酯苷A的含量均大于0.25%，连翘苷的含量均大于0.15%，均符合2015年版《中国药典》要求。其中，以苯乙醇苷类成分的含量最高，占总质量浓度的69.51%～82.85%，木脂素类成分的含量次之，黄酮类及酚酸类成分的含量较低。不同产地和商品药材中21种活性成分的含量存在一定差异，21种成分的总量以山西产药材样品(S2、S3、S4)最高，其中苯乙醇苷类、木脂素类成分的总量均以山西样品(S2 、S3、S4)最高，这与连翘药材的传统道地产区相吻合。说明连翘药材的品质形成可能受产区生态环境、药材采收加工等诸多因素的综合影响。

表7 连翘中21种目标成分的含量测定结果(n=3，μg/g)Table 7 Determined results of 21 constituents in Forsythiae Fructus(n=3，μg/g)

*the compound numbers denoted were the same as those in Table 4;**not detected

图4 连翘中4类目标成分含量的柱状堆积图Fig.4 Columnar stacked diagram of 4 types of target constituents in Forsythiae Fructus

3 结 论

本文针对连翘多种药效成分的特点，用响应面法优化了样品提取条件，建立了UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定连翘中苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类及酚酸类共21种活性成分含量的方法，并对连翘不同产地及商品药材进行比较分析。本方法灵敏度高、准确可靠，实现了包括痕量组分在内的多元活性成分的同时测定，可为连翘药材内在质量的综合评价和全面控制提供参考依据。