液液萃取/液相色谱-串联质谱法分析海水中的短裸甲藻毒素

2020-01-08严忠雍曾军杰

分析测试学报 2019年12期

严忠雍，曾军杰，龙举，方益，陈思*

(1.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021;2.浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021)

短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是由反式聚合醚环构成的亲脂性藻类毒素，也称神经性贝类毒素，主要由短裸甲藻及裸甲藻属部分藻类产生的赤潮藻毒素[1-3]。短裸甲藻毒素不仅污染海洋水体环境，还会造成海洋鱼类死亡，从而带来严重的海洋经济损失[4-5]。此外，短裸甲藻毒素亦能雾化在波浪形成的气溶胶中，人接触或吸入后会刺激皮肤，甚至引起膜炎、鼻漏、支气管收缩等呼吸系统症状[6-11]。目前，国内外尚未有海水中短裸甲藻毒素的限量标准及相关规定。美国通过监控短裸甲藻的细胞密度以预防短裸甲藻毒素的大规模爆发入侵：即每升海水中短裸甲藻的细胞数量≥5 000个时，禁止在受污染的相关海域捕捞贝类[12]。海水中短裸甲藻毒素限量标准的缺乏以及以藻细胞密度衡量污染状况的规定，导致现有文献多以短裸甲藻细胞密度为分析点，间接评价海水中短裸甲藻毒素的安全风险水平[13]。

海水分析通常采用固相萃取和液液萃取提取净化目标物，但考虑到固相萃取成本较高，故本研究基于液相色谱-串联质谱检测技术，结合海水的基质特征，选择液液萃取作为前处理方法。通过筛选合适的提取试剂，对提取体积、旋涡时间、提取次数、盐析剂等参数进行单因素实验分析；并在单因素实验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法，确定海水中短裸甲藻毒素的最佳提取条件；最后通过回收率、精密度、定量下限等指标进行方法学验证，建立了适用于海水中短裸甲藻毒素的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITYTMI-Class超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S质谱仪(美国Waters公司)；Avanti JXN-30高速离心机(美国Beckman Coulter公司);MS3 Control旋涡混匀器(德国IKA公司);VSD150氮吹仪(无锡沃信仪器制造有限公司)；FG2-B便携式 pH计(瑞士Mettler Toledo公司)；AZ8371便携式盐度计(台湾衡欣仪器仪表有限公司)。

BTX-1、BTX-2、BTX-3短裸甲藻毒素标准品均为100 μg(台湾Algalchem公司)；乙酸铵、甲酸(色谱纯，美国Sigma公司)；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷(色谱纯，德国Merck公司)；氯化钠、氨水、乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；实验用水均为经Millipore系统处理的超纯水。

1.2 响应面实验样品前处理

移取经0.45 μm玻璃微纤维滤纸过滤的20 mL海水至50 mL离心管，加入100 μL 100 ng/mL的BTX混合标准工作液、盐析剂和提取试剂后，旋涡混合，6 000 r/min离心5 min，将有机层转移至15 mL离心管中，再复提取，合并上清液后于40 ℃水浴条件下氮气吹干；加入1 mL乙腈，旋涡混合60 s，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，供LC-MS/MS分析。

1.3 样品前处理方法

移取20 mL经0.45 μm玻璃微纤维滤纸过滤的海水样品至50 mL离心管中，加入6 g氯化钠旋涡混合90 s，再加入5 mL乙酸乙酯，旋涡振荡60 s后，6 000 r/min离心5 min，将上清液转移至15 mL离心管中；加入5 mL乙酸乙酯再提取1次，合并上清液后于40 ℃水浴条件下氮气吹干；加入1 mL乙腈，旋涡混合60 s，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后，供LC-MS/MS分析。

1.4 色谱-质谱条件

色谱柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；进样体积5 μL；样品室温度10 ℃；柱温35 ℃；流速0.2 mL/min；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱：0～1.0 min，50% A；1.0～2.0 min，50%～65%A；2.0～9.0 min，65% A；9.0～9.5 min，65%～50%A；9.5～11 min，50% A。

电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测模式；毛细管电压：2.5 kV；离子源温度：130 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；锥孔气流量：200 L/h；脱溶剂气流量：800 L/h；短裸甲藻毒素的质谱参数见表1。

表1 3种短裸甲藻毒素的质谱参数Table 1 MS parameters of three BTXs

*quantitative ion

1.5 数据处理

采用SPSS 19软件对实验数据进行分析处理；采用Design expert 8.0响应面软件进行模型方程拟合和多元回归分析。

2 结果与讨论

2.1 海水体积的确定

Pierce等[14]对海水中短裸甲藻毒素的含量(BTX-1、BTX-2、BTX-3的总和)与短裸甲藻的细胞密度之间的相关性进行研究，发现单个藻细胞的毒力水平为14～323 pg，5 000个细胞的毒力水平为70～1 615 ng，即常规海水中的短裸甲藻毒素含量应小于0.07 μg/L。结合仪器灵敏度，计算得到海水定量分析所需的体积约为15 mL；考虑到方法前处理的损失和实验数据的偏差，将海水体积确定为20 mL。相较于传统的细胞计数法[12]，这不仅减少了海水分析所需体积，降低了耗材试剂量；同时也能满足海水定量分析的需要，从而有效评估短裸甲藻毒素的安全风险水平。

2.2 提取试剂对萃取的影响

短裸甲藻毒素属脂溶性聚醚类藻毒素，且样品基质是海水，应优先考虑能与水分层的有机试剂，以便于分离移取提取试剂，缩短前处理时间，提高实验效率。因此，实验分别选择乙酸乙酯、三氯甲烷、正己烷3种常用色谱提取有机溶剂，比较其对海水中BTX萃取效率的影响。结果显示，正己烷的萃取效率最低(48%～62%)，三氯甲烷的萃取效率为71%～75%，但其易氧化，属2B类致癌物，且离心后在水层之下不易移取；而乙酸乙酯的萃取效率为74%～79%，低毒且易移取，便于操作。故本实验选择乙酸乙酯为最佳提取试剂。

2.3 提取体积对萃取的影响

乙酸乙酯微溶于水，过低的提取体积会导致无法收集有效有机层；而过高的提取体积则加大了试剂量，延长了浓缩时间，降低了实验效率。结合液液萃取少量多次的原则，本实验选择3、4、5、6 mL乙酸乙酯提取两次。结果显示(以3种BTX总量计)，3 mL的乙酸乙酯由于第一次提取时体积较少，部分乙酸乙酯溶至水中，导致萃取率较低(为78%)；4、5、6 mL乙酸乙酯的萃取率分别为88%、90%、91%，3种提取体积的萃取率差异不大。出于降低试剂量，缩短前处理时间的考虑,最终选择用乙酸乙酯提取两次，每次5 mL。

图1 氯化钠质量对3种短裸甲藻毒素萃取率的影响Fig.1 Effect of NaCl amount on extraction efficiencies of three BTXs

2.4 盐析剂对萃取的影响

在萃取过程中，常加入溶于水相但不被萃取的无机盐作为盐析剂，以吸引一部分自由水分子，减少水溶液中自由水分子的量，降低被萃取物和提取溶液在水中的溶解度，从而提高萃取效率[15]。实验选择氯化钠为盐析剂，分别加入0、1、2、3、4、5、6、7 g(因7 g氯化钠在20 mL海水中已饱和，故未再往上增加量)，考察了不同质量盐析剂对短裸甲藻毒素萃取效率的影响。结果如图1所示，当氯化钠的质量为6 g时，萃取率达到最高；而其它质量对应的萃取率由于水合作用不充分或溶液体系失衡等原因未能达到最佳值，故选择6 g氯化钠为最佳盐析剂的用量。

2.5 旋涡时间对萃取的影响

液液萃取通常需要萃取剂与被萃取溶剂长时间混匀振荡，从而充分提取被萃取溶剂中的目标化合物。由于海水体积较少，无需采用分液漏斗，故使用50 mL离心管即可，并选择色谱前处理常用的旋涡混匀器充分提取海水中的短裸甲藻毒素。实验分别旋涡混合30、60、90、120 s，考察了不同旋涡时间对3种短裸甲藻毒素萃取效率的影响。结果显示，3种短裸甲藻毒素在30 s旋涡时间时的萃取效率较低，而在60、90、120 s时的萃取效率相近；考虑到90 s和120 s的旋涡时间相对较长，延长了前处理时间、降低了实验效率，最终选择最佳旋涡时间为60 s。

表2 海水中BTX萃取条件优化实验的因素水平表Table 2 Factors and level for optimizing the extraction conditions of BTX in seawater

表3 响应面分析方案和实验结果Table 3 Response surface analysis scheme and experimental results

2.6 响应面优化实验

经过上述单因素数据分析，可知海水中短裸甲藻毒素的最佳萃取条件为：以乙酸乙酯提取2次，每次5 mL，加6 g氯化钠作为盐析剂，每次萃取旋涡时间为60 s。为达到更好的萃取效率，精准量化多因素的影响水平，根据中心组合实验设计原理，选取提取体积(A)、氯化钠质量(B)、旋涡时间(C)为考察变量，以3种短裸甲藻毒素(以3种BTX总量计)的萃取效率为响应值，设计三因素三水平的响应面分析方法。每个变量因素的低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码，试验因素与水平设计见表2。采用Design expert.8.0响应面软件对数据进行分析，结果见表3。序号3、6、10、11和13为中心试验，其它序号为析因试验，16个试验点分为零点和析因点，零点为中心点，试验重复4次，用以评估误差。得到二次多项回归模型方程为：萃取率=99.82+1.34A+0.76B+2.25C+0.32A×B+0.90A×C+0.20B×C-1.92A2-2.72B2-1.90C2。

中心组合设计回归分析结果如表4所示，该模型F值为7.87，P值为0.006 3(小于0.05)，具有显著性；失拟项F值为0.31，P值为0.820 7(大于0.05)，不具显著性，表明该模型能与实验良好拟合，实验误差较小。决定系数(R2)为0.910 0，反应预测值和实验测定值具有良好的相关性，表明该模型能代表实验结果，可对海水中BTX含量进行分析和预测。由模型计算可知，在单因素条件下A、C对萃取率有显著性影响(P小于0.05)，B对其影响不显著，A2、B2、C2对萃取率的影响显著。通过比较A、B、C的F值可知，旋涡时间对萃取率的影响最大，其次是提取体积，而氯化钠质量的影响最小。

表4 回归分析结果Table 4 Regression analysis results

图2 响应曲面图Fig.2 Response surface plots of extractionⅠ.amount of NaCl and extraction solvent volume；Ⅱ.Vortex time and extraction solvent volume；Ⅲ.Vortex time and amount of NaCl

对A、B、C 3个因素进行两两交互作用分析，以任意两个因素为研究因子，萃取率为因变量，绘制响应曲面图，见图2(Ⅰ～Ⅲ)。3张响应面分析图均呈山丘形曲面，存在极大值，经响应面模拟分析可得最佳萃取条件为：提取体积5.07 mL，氯化钠质量6.07 g，旋涡时间60.72 s；但考虑到实际操作和实验效率，将萃取条件调整如下：提取体积5 mL，氯化钠质量6 g，旋涡时间60 s。为进一步验证响应面法的可靠性，采用上述条件对海水中3种短裸甲藻毒素进行萃取，实际测定的萃取率与理论预测值相比，相对误差为1.6%。表明响应面法能有效反映各因素对萃取率的影响程度，并精确预测趋势理论值，因此采用响应面法优化得到的海水中短裸甲藻毒素萃取率的参数稳定可靠，具有实际使用价值。

2.7 方法学评价

分别移取100 μg/L BTX混合标准工作液0.01、0.05、0.1、0.2 mL，1 mg/L BTX混合标准中间液0.05、0.2 mL，配制质量浓度分别为1、5、10、20、50、200 μg/L的系列标准工作溶液，以BTX的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。结果显示，3种BTX在1～200 μg/L质量浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数均大于0.996。根据20 mL的海水体积，结合3倍和10倍信噪比，得到本方法中3种BTX的检出限均为0.02 μg/L，定量下限均为0.05 μg/L。

采用阴性海水加标回收实验考察本方法的准确度和精密度，即在20 mL阴性海水样品中添加3种BTX混合标准工作液，使其加标浓度分别为0.1、0.3、1.0 μg/L，每个浓度水平重复6次，连续测定3天，依次计算回收率、日内相对标准偏差(RSD)及日间相对标准偏差，结果见表5。在0.1、0.3、1.0 μg/L 3个加标浓度水平下，3种BTX的回收率为95.4%～104%，日内相对标准偏差为2.2%～5.3%，日间相对标准偏差为3.0%～4.5%，表明方法具有良好的准确度和精密度。

表5 海水中BTX的平均回收率及相对标准偏差Table 5 Average recoveries and RSDs for BTX in seawater

2.8 实际样品的分析

应用基于液液萃取的液相色谱-串联质谱分析方法，对浙江省沿岸共计20 份海水样品进行前处理与检测。以本方法检出限(0.02 μg/L)为依据，判定检测样品是否含有短裸甲藻毒素。结果显示，样品均未检出BTX，表明常规海水是相对安全的，未受短裸甲藻毒素污染。本研究通过实验室培养短裸甲藻(Kareniabrevis)的方式，测定其培养海水中3种短裸甲藻毒素的含量，进一步验证本方法的时效性。结果显示，海水中未检出BTX-1，检出BTX-2质量浓度为38 μg/L，BTX-3为56 μg/L；表明方法能有效测定海水中短裸甲藻毒素。