草鱼鳞胶原蛋白纳米银溶胶的制备及其对水中Cr(Ⅲ) 的检测

刘付玉，何 利，曹 舒，王 潇，刘书亮，陈姝娟

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625000)

鱼类产品的下脚料占鱼鲜总质量的1/2，有鱼鳞、鱼骨和鱼鳍等[1]，其中鱼鳞最多。鱼鳞可在高纯度下制备胶原蛋白[2]，是稳定的胶原蛋白的来源。草鱼鳞胶原蛋白是一种环境友好型的可再生天然高分子材料，有较好的分散性和稳定能力，是一种良好载体[3]。

纳米材料作为新兴的功能材料，已成为环境和生物检测领域的研究热点，其中纳米银是研究最多的材料之一[4]。纳米银材料具有独特的表面等离子体共振效应[5]、表面增强拉曼散射效应[6]和荧光增强性质[7]，在检测方面发挥着重要作用。目前纳米银的常用合成方法有真空冷凝法[8]、化学还原法[9]、微生物还原法[10]等。其中化学还原法因可通过控制化学反应速度改变纳米银粒径的优点而得到了较为广泛的应用[11]。采用化学还原法制备纳米银时，为增强其稳定性，常用十二烷基硫酸钠、聚甲基乙烯醚[12]等作为保护剂。但大部分化学稳定剂有较强毒性，对环境污染严重。本文采用绿色安全的草鱼鳞胶原蛋白作为稳定剂，并以AgNO3为银源，茶多酚(TP)为还原剂，通过化学还原法快速合成了草鱼鳞胶原蛋白纳米银(Col-nAg)溶胶。

铬在自然界中广泛存在，是世界卫生组织公布的强致癌物之一。目前，检测水中Cr3+的国标方法[13](高锰酸钾氧化一二苯碳酸二阱分光光度法、硫酸亚铁铁滴定法)和火焰原子吸收光谱法[14]均存在前处理复杂、仪器昂贵、易受其他离子干扰等缺点。本文将Col-nAg溶胶用于水中Cr3+的检测，利用反应前后Col-nAg溶胶的颜色变化可肉眼直接观察检测结果，检测时间短(5 min)，操作方便、简单，选择性较强，有望用于现场快速检测水中Cr3+。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

atoriusCP225D电子天平(Sartorims公司)；HWS24电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Gradient超纯水系统(Millipore公司)；UV-1800PC紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；85-2恒温磁力搅拌器(金坛市城东新瑞仪器厂)；PB-2B pH计(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

草鱼鳞购于四川省雅安市苍坪山农贸市场；铬标准液(1 000 mg/L，国家标准物质中心，北京普天同创生物科技有限公司)；硝酸银、重铬酸钾、茶多酚(TP)、硝酸、氢氧化钠、盐酸、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O(成都市科龙化工试剂厂)。以上试剂均为分析纯，实验验用水为超纯水。

实验室自提草鱼鳞胶原蛋白，提取方法参照文献[15]。1%草鱼鳞胶原蛋白溶液的配制：以0.5 mol/L的醋酸溶液为溶剂,加入冻干保存的鱼鳞胶原蛋白，配制得到1%的草鱼鳞胶原蛋白溶液。

1.2 草鱼鳞胶原蛋白纳米银溶胶的制备与表征

25 ℃下向三角瓶中加入10 mL 1%草鱼鳞胶原蛋白溶液搅拌30 min，将10 mL 0.02 mol/L AgNO3溶液滴加到体系中充分搅拌30 min，恒速滴加2 mol/L TP溶液直至溶胶颜色变为黄色，用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液调至pH 7.0，室温下持续搅拌30 min，将得到的黄色草鱼鳞胶原蛋白纳米银溶胶(Col-nAg溶胶)样品置于4 ℃条件下避光保存。考察AgNO3浓度(0.01、0.02、0.03 mol/L)、pH值(3.0、7.0、11.0)及TP浓度(1、2、4 mol/L)对Col-nAg溶胶制备的影响，以UV-Vis和TEM对其进行表征。

1.3 Col-nAg溶胶的稳定性研究

考察温度(4、25、40 ℃)、时间(0、1、2、3、4、5、6、7、10、15、25、30、45、60 d)、磷酸盐缓冲液浓度(0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mol/L)、电解质(NaCl、(NH4)2SO2、Na2SO4)及其浓度(1.0、3.0、5.0 mol/L)对Col-nAg溶胶稳定性的影响。按照“1.2”制备Col-nAg溶胶，测定其紫外吸光度值。

1.4 Col-nAg溶胶检测水中Cr3+

1.5 Col-nAg溶胶在实际水中的应用

对自来水和河水进行加标回收实验，分别取1 mL待测试样，向其中加入100 μL质量浓度分别为2、5、10 μg/mL的Cr3+溶液混合后，加入1 mL的Col-nAg溶胶充分混匀，反应5 min，测定其紫外吸光度值，采用标准加入法测定水样中Cr3+回收率，每组测定做6次重复。

2 结果与讨论

2.1 Col-nAg溶胶制备条件优化

2.1.1 AgNO3浓度对Col-nAg溶胶制备的影响图1A显示，3个样品在410 nm处均有紫外吸收峰，此吸收峰是球形纳米银的特征吸收峰[16]。随着AgNO3浓度的增大，Col-nAg溶胶颜色变深，吸收峰强度增大，峰形变宽，峰位红移。原因是银晶体的形成包括成核和晶体生长两个过程，加入AgNO3前期以成核为主，后期以核生长为主。一方面，Ag+浓度的上升使前期形成的晶核增多，但后期提供晶核生长的单质银更多，从而纳米银的粒径增大，溶胶颜色变深。另一方面，银晶体浓度的上升，增大了晶粒之间碰撞的机率，易造成粒径不均衡分布和变大[17]。因此吸光度值随AgNO3浓度的增大而增大，合成的溶胶增多，但纳米银粒径与AgNO3浓度呈正相关，综合考虑，本实验制备Col-nAg溶胶选用AgNO3浓度为0.02 mol/L。

2.1.2 pH值对Col-nAg溶胶制备的影响图1B显示，样品在410 nm处均有紫外特征吸收峰[16]。pH 3.0时，溶胶为浅黄色，吸收峰强度较弱，这是因为TP的还原作用被抑制，制得的纳米银较少。pH 7.0时，溶胶为明黄色，纳米银未发生团聚，表明Col-nAg溶胶在中性条件下稳定。pH 11.0时，溶胶由黄色变成红褐色，主要是因为用0.01 mol/L NaOH溶液调节pH值，易使反应溶液局部碱性过强，导致TP不稳定而析出且氧化褐变为红褐色[17]，从而影响Col-nAg溶胶的制备。因此pH 7.0时，纳米银颗粒分散性、稳定性好，故本实验制备Col-nAg溶胶选用pH值为7.0。

2.1.3 TP浓度对Col-nAg溶胶制备的影响图1C显示，样品在410 nm处的紫外特征吸收峰强度随着TP浓度的增大而增大，且吸收峰位置发生红移，表明纳米银粒径增大。TEM结果与紫外一致，图2显示，随着TP浓度的增大，纳米银的平均粒径增大，1、2、4 mol/L TP对应的纳米银的粒径分别为3.35、4.45、7.25 nm。因为TP浓度增大，还原速度加快，晶粒因不能及时扩散而聚集，粒径变大。图2A中纳米银颗粒形貌不规则，多为非球形。图2B中为规则的球形。A,B中的个别颗粒发生团聚。图2C中纳米银颗粒为大小均匀的球形，且规律排序，无团聚现象，原因在于高浓度的TP对纳米银有稳定、分散的作用[18]。草鱼鳞胶原蛋白对纳米银颗粒规则的形貌和优良的分散性也有一定影响[19]，胶原蛋白结构中的—OH、—COOH和—NH2通过与纳米银功能性基团之间的静电、氢键及共价键作用紧密结合形成聚合物层[20]，包裹住纳米银使晶核稳定分布、有限扩散生长。实验浓度范围内，随着TP浓度增加，纳米银粒径变大，且高浓度TP下纳米银分散性更好，为满足纳米银颗粒有良好分散性的同时平均粒径较小、形貌规则，本实验选用2 mol/L 的TP 制备Col-nAg溶胶。

图1 不同AgNO3浓度(A)、pH值(B)和TP浓度(C)下制备的Col-nAg溶胶的UV-Vis图Fig.1 UV-Vis charts of Col-nAg sols with different AgNO3 concentrations(A),pH(B) and TP concentrations (C)

2.2 Col-nAg溶胶的稳定性分析

2.2.1 温度/时间对Col-nAg溶胶的影响图3A显示，在4 ℃时，Col-nAg溶胶相对稳定，对比第60 d与第1 d的样品，发现溶胶颜色无显著变化，紫外吸光度值基本一致。25 ℃时，60 d后纳米银部分析出，溶胶颜色变灰，这是因为胶原蛋白分子运动速度加快，纳米银颗粒与活性基团之间的氢键作用减弱导致析出。40 ℃时，胶原蛋白已变性(草鱼鳞胶原蛋白变性温度为34.5 ℃)，Col-nAg溶胶完全沉淀[20]。故Col-nAg溶胶在4 ℃、60 d内稳定。

图2 1 mol/L(A)、2 mol/L(B)、4 mol/L(C)TP浓度下Col-nAg溶胶的TEM图及对应的粒径分布图Fig.2 Col-nAg sol TEM and particle size distribution diagrams with 1 mol/L(A),2 mol/L(B) and 4 mol/L(C) TP

2.2.2 磷酸盐缓冲液浓度对Col-nAg溶胶的影响图3B显示，pH 7.0时，随着磷酸盐缓冲液浓度的增大，Col-nAg溶胶的吸光度值无明显变化，表明不同浓度的磷酸盐缓冲液对溶胶稳定性无明显影响。

2.2.3 电解质对Col-nAg溶胶的影响图3C显示，3种电解质对Col-nAg溶胶稳定性的影响基本相同。电解质浓度为1、2、3 mol/L时，溶胶紫外吸光值稍有增大，因为制备Col-nAg溶胶时，少量电解质存在有助于纳米银胶团双电层和胶粒电势的形成，对溶胶的稳定性具有促进作用。当电解质浓度为4 mol/L或5 mol/L时，吸光度值降低，这是因为增多的外加电解质夺取了纳米银颗粒所带的电荷，使得溶胶团被破坏，发生聚沉[22]。因此低浓度的电解质对Col-nAg溶胶稳定性有促进作用，而高浓度有破坏作用。所以，后续实验中电解质均设置为1 mol/L的NaCl。

2.3 Col-nAg溶胶检测水中Cr3+的结果分析

2.3.1 检测条件的优化溶液酸度会影响Ag+表面电荷和金属离子的水解状态，但实验发现，pH 3.0～6.0时，Col-nAg溶胶吸光度值变化不大，可能是因为Col-nAg溶胶中草鱼鳞胶原蛋白表面基团的作用使得即使酸度增加也不影响Cr3+的检测。pH 8.0～11.0时，吸光度值略有增大，但碱性条件下Col-nAg溶胶中的TP不稳定且易析出氧化褐变[17]。pH 6.0～8.0时，吸光度值比酸性条件下高，且pH 7.0时纳米银更稳定，而待测样品pH值较易调节为7.0，故本实验选用检测pH值为7.0。

图3 不同温度和时间(A)、磷酸盐缓冲液浓度(B)和电解质浓度(C)下Col-nAg溶胶的UV-Vis图Fig.3 UV-Vis charts of Col-nAg sols with different temperatures and time(A),phosphate buffer concentrations(B) and electrolyte concentrations(C)

温度为20 ～30 ℃时，Col-nAg溶胶吸光度值无明显变化。4 ℃时，吸光度值有所减小，是因为反应温度太低，Col-nAg溶胶与Cr3+反应速度缓慢且没有充分反应。40 ℃时，吸光度值增大，是因为草鱼鳞胶原蛋白在40 ℃时已变性，纳米银颗粒聚集。结果显示，20 ～30 ℃有利于Col-nAg溶胶检测Cr3+，故本实验选用检测温度为25 ℃。

实验发现，反应时间在1～5 min内时，随着时间的延长，Col-nAg溶胶吸光度值不断增大，5 min时达到最大。在5～60 min时，吸光度值保持最大且稳定。表明Col-nAg溶胶与Cr3+在5 min时反应完全，故本实验选用检测时间为5 min。

2.3.2 Col-nAg溶胶检测水中Cr3+取1 mL Col-nAg溶胶3份，分别与超纯水、Cr3+和Cr6+溶液等体积混合，反应5 min。发现加入Cr3+后溶胶颜色变为褐色，而其他溶胶颜色无变化。

图4 Col-nAg溶胶比色检测Cr3+的机理Fig.4 Mechanism of Col-nAg sol colorimetric detection of Cr3+

对样品进行UV-Vis表征，发现加入Cr6+的溶胶吸收峰未红移，但吸收峰强度增大。而Cr3+的吸收峰红移及吸收峰强度变化最大，对其进行TEM表征，发现加入Cr3+后，纳米银颗粒发生团聚，粒径变大，这是因为胶原蛋白的—COOH与Cr3+发生了络合反应(图4)，破坏了Col-nAg溶胶的稳定性，使纳米银发生团聚，银纳米颗粒特有的表面等离子共振峰发生变化，从而导致纳米银的颜色改变(从黄色变为褐色)，并发生紫外吸收的变化[23]，因此根据溶胶紫外吸收值的变化与Cr3+浓度的关系建立了一种肉眼观测和定量检测水中Cr3+的检测方法。

2.3.3 Cr3+浓度对检测的影响实验发现，在410 nm处，随着Cr3+浓度的增加，Col-nAg溶胶紫外吸收峰强度增大，峰位红移。因为Cr3+改变了纳米银所在的化学环境，且Cr3+的浓度越大，胶原蛋白和Cr3+的作用越强。结果显示，Col-nAg溶胶的吸收峰强度(Y)与Cr3+质量浓度(X)在0～10 μg/mL范围内有较好的线性关系，线性回归方程为Y=0.11 416X-0.03 044，r2=0.994。根据空白样品信噪比的3倍(S/N=3)计算Col-nAg溶胶对Cr3+的检出限为0.5 μg/mL。与其它检测Cr3+的方法比较(表1)发现，该方法具有反应时间短(5 min)、样品前处理简单、无需昂贵仪器、操作简便、成本低等优点。

表1 与其他Cr3+的检测方法的比较Table 1 Comparison with other methods for Cr3+ detection

2.3.4 Col-nAg溶胶选择性研究考察了水中常见离子的干扰情况，结果发现，在Cr3+浓度为10 μg/mL，误差为±0.1%的条件下，1倍的“1.4”中所述阴离子和1倍的金属阳离子均不干扰测定。而5倍和10倍的“1.4”中所述金属阳离子中Cu2+有一定程度的干扰，可通过电化学法去除。

2.4 Col-nAg溶胶在实际水样中的应用

分别对自来水和河水进行2、5、10 μg/mL 3个水平的加标实验，每个水平平行实验6次，结果显示，自来水的回收率为83.0%～97.6%，河水为81.0%～97.5%，相对标准偏差(RSD)均不超过3.0%。准确度达到生活饮水标准检验方法[24]国标要求，有望用于实际污水样品中Cr3+的快速检测。

表2 自来水和河水测定结果(n=6)Table 2 Detection results of tap water and river water (n=6)

3 结 论

以草鱼鳞胶原蛋白为稳定剂，AgNO3为银源，TP为还原剂，采用化学还原法合成Col-nAg溶胶。当制备条件为0.02 mol/L AgNO3，pH 7.0和2 mol/L TP时，可获得平均粒径为4.45 nm，分布均匀、性质稳定的纳米银溶胶。将其用于比色法快速检测水中Cr3+，可在适宜条件下(pH 7.0，25 ℃)，快速 (响应时间5 min)、准确地检测出样品中Cr3+含量。该方法对Cr3+的检出限为0.5 μg/mL，具有选择性好、无需昂贵仪器、操作简便、成本低等优点，有望应用于实际检测工作中。