纳米金-核酸适配体快速可视化检测药材中4种有机磷农药的方法研究

刘媛媛，陈媛媛，张红艳，尤金坤，魏小红，余宇燕

(福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122)

中药材因其独特的疗效和天然活性被广泛用于药物制剂、保健品、食品等领域。然而，一些药农为提高中药材的产量和利润，过度使用农药，使其在药材中残留成为安全隐患[1-3]。有机磷农药是指含磷元素的有机化合物农药，是一种神经毒物，主要用于防治植物病、虫、草害，广泛用于农业生产[4-5]，但在农作物中会发生不同程度的残留。有机磷农药会使乙酰胆碱酯酶失活造成中枢神经系统紊乱，表现出震颤、出汗、精神错乱、语言失常等一系列神经中毒症状，严重者会出现呼吸麻痹，甚至危及生命[6-9]。

图1 纳米金可视化检测原理图Fig.1 Nano gold visual inspection schematic

传统的有机磷残留检测方法多为色谱法[10]，虽然可进行多成分同时检测、准确度高，但其仪器较昂贵，预处理繁琐、耗时长，对仪器和操作人员要求较高[11-12]。目前，农药有机磷残留的常用快速检测方法有酶抑制法和免疫分析法[13]。酶抑制法主要利用有机磷农药的特性来抑制乙酰胆碱酯酶的活性，虽然检测成本低、易于操作[14-15]，但酶易失活不稳定，导致检测结果的误差较大。免疫分析法虽特异性强，但抗体制备周期长、成本高[16]，实际应用困难。

本研究选取可与有机磷农药特异性结合的适配体[17]作为识别元件，建立了甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷、水胺硫磷4种有机磷农药的快速检测技术，正常条件下，体系中柠檬酸根离子附着金纳米粒子表面可形成静电保护层，使纳米金颗粒均匀分散在体系中形成稳定的胶体溶液。在高盐环境下纳米金发生聚集，从而产生颜色和吸收光谱的变化；若在体系中加入适配体，金纳米粒子与适配体通过静电吸附作用结合，适配体可以保护金纳米粒子在溶液中保持分散状态，免受盐的诱导，体系颜色不变；再加入待测靶标后，核酸适配体与纳米金表面解离，并与靶标结合，金纳米粒子失去保护，在高盐浓度下聚集，溶液的颜色由红色变蓝紫色，颜色的变化程度与添加目标物的浓度呈正相关，其检测机理见图1。通过表征金纳米粒子体系颜色变化，可实现对药材中4种有机磷农药(甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷、水胺硫磷)的可视化检测。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Infinite M200 PRO多功能酶标仪(Tecan仪器公司)；KQ116型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FiveEasy Plus型精密pH计、ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；涡旋仪(Kylin-Bell Lab仪器公司)。

氯金酸(HAuCl4·4H2O，国药化学试剂有限公司)；乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸三钠、三羟甲基氨基甲烷(上海化学试剂总厂)；氯化钠、浓硝酸、浓盐酸、甲醇、氯化钾、二甲基甲酰胺、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾(国药化学试剂有限公司)；以上试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷、水胺硫磷、乐果标准品(阿拉丁有限公司)；马拉硫磷、辛硫磷、庚虫磷、硫线磷标准品(百灵威有限公司)；实验药材样品：金银花、菊花、槐花、山楂、葛根、干姜、枸杞(经福建中医药大学范世明教授鉴定)；有机磷适配体序列5′-AAG CTT GCT TTA TAG CCT GCA GCG ATT CTT GAT CGG AAA AGG CTG AGA GCT ACG C-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司制备合成。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备纳米金：取1 mL 1%氯金酸溶液用超纯水稀释至100 mL，倒入锥形瓶中放入磁力搅拌子，转速调至最低，加热至溶液沸腾。然后，将搅拌速度调至600 r/min，快速加入3 mL 1%柠檬酸三钠溶液至煮沸的氯金酸溶液中，反应15 min。反应结束后，待颜色不再变化时，移除热源,继续搅拌待温度降至室温后，过0.22 μm滤膜，即得纳米金胶体溶液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.2.2 适配体纳米金比色法检测多种有机磷农药为满足现场快速检测需要，检测过程在室温下进行。在96孔板中加入150 μL纳米金溶液和30 μL适配体，混合均匀后，室温孵育15 min；分别加入30 μL不同浓度的靶标标准液，室温孵育20 min；再向孔中加入30 μL 200 mmol/L氯化钠溶液并混合均匀。通过肉眼即可观察到明显的溶液颜色变化。

1.2.3 特异性试验根据文献[17]确定待测有机磷农药甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷、水胺硫磷的类似物马拉硫磷、辛硫磷、庚虫磷、硫线磷、乐果作为方法的特异性考察对象，对传感器进行检测。

1.2.4 实际样品检测以常用药食同源药材金银花、菊花、槐花、山楂、葛根、干姜、枸杞为检测样品，每个样品选3批不同产地的药材。

样品前处理：取药材样品，粉碎，过100目筛，混匀，取5 g于50 mL离心管中，加入30 mL甲醇，先漩涡振荡1 min，然后以4 000 r/min离心8 min。取5 mL上清液加入15 mL离心管中(事先加入PSA 125 mg、无水硫酸镁300 mg)，然后涡旋振荡1 min，于4 000 r/min离心5 min，取上清液，待测。

2 结果与讨论

2.1 纳米金的表征结果

新制备的柠檬酸三钠还原纳米金溶液为颜色鲜艳的酒红胶体溶液(图2A)，其特征吸收峰在520 nm处，峰形较尖锐，表明新制备的金纳米粒子性能较好，粒径均匀。用H7650透射电镜对纳米金颗粒的外观形态进行表征(图2B)，发现纳米金粒子表观呈统一的圆球形，粒径均一，分布也比较均匀。使用粒径仪对其进行检测，得其平均粒径为18.74 nm。以上结果表明本次合成的纳米金色泽均匀，分散性良好，粒径均一，具有稳定的性质，符合实验要求。

图3 纳米金溶液体积的选择Fig.3 Volume selection of nano gold solution

2.2 实验条件优化

2.2.1 纳米金溶液体积的选择纳米金溶液是整个检测体系的颜色指示剂，其在系统中的比例直接影响检测方法的灵敏度。为获得可通过肉眼明显鉴别的颜色，通过向溶液中加入30 μL 100 mmol/L NaCl溶液，优化纳米金在体系中的体积分数(40.0%、50.0%、62.5%、70.0%),结果见图3，当纳米金体积分数小于62.5%时，体系极易变蓝；当纳米金体积分数为62.5%时，体系刚好由红色转变为蓝紫色；因此选择纳米金体积分数为62.5%，即向反应体系中加入150 μL纳米金溶液。

2.2.2 NaCl浓度的选择金纳米粒子会在盐的诱导下发生聚集，随着盐浓度的增加，金纳米粒子的聚集程度会不断加深，从而使溶液的颜色由酒红色变为紫色，最终变为蓝色。盐浓度过大时，金纳米粒子可能会在没有靶标的情况下直接发生聚集，盐浓度过小则会导致金纳米粒子发生部分聚集影响实验结果，因此需进行盐(NaCl)浓度优化。在最佳(150 μL)纳米金溶液体积下，以超纯水代替适配体，甲醇代替靶标，再加入30 μL不同浓度(50、100、150、200、300、350 mmol/L)的NaCl溶液，混匀，放置5 min后观察溶液的颜色并分别测定吸光值。结果表明，随着NaCl浓度的逐渐增加，金纳米粒子发生聚集的效果越来越显著，体系颜色由红色变为蓝色。当NaCl浓度低于200 mmol/L时，金纳米粒子呈红色，此时的盐浓度无法使金纳米粒子发生聚集；当NaCl为200 mmol/L时，金纳米粒子的吸光度值急剧下降，粒子团聚程度增大。但随着盐浓度的增加，核酸适配体对金纳米粒子的保护作用不足以抵抗盐的作用，金纳米粒子发生直接聚集，影响体系的检测灵敏度。因此，NaCl的最优浓度选择为200 mmol/L。

2.2.3 测试环境pH值的优化适配体与有机磷之间的作用会受到环境pH值的影响，实验考察了不同pH值(5.0、6.8、7.4、8.5)的测试环境对体系灵敏度的影响。结果显示，当pH值为7.4时，体系的颜色变化最明显；当pH值低于6.8时，颜色变化直观效果减弱，可能是由于在酸性环境下，核酸适配体活性降低，使之保护金纳米粒子的能力减弱；当pH值高于8.5时，影响金纳米粒子表面柠檬酸根离子，金纳米粒子表面的双电层受到破坏，导致其与适配体间的静电吸附作用减弱，从而降低了两者结合的稳定性。故选择实验环境的pH值为7.4。

2.2.4 金纳米粒子-核酸适配体的反应时间将150 μL纳米金溶液与30 μL 0.1 μmol/L核酸适配体混匀，静置0、5、10、15、20、25 min后，分别加入30 μL 200 mmol/L NaCl，静置5 min，测定其吸收光谱。结果显示，随着核酸适配体-纳米金作用时间的逐渐延长，520 nm处的金纳米粒子吸收值也逐渐上升，当反应时间至15 min时，其吸收值不再有明显变化，表明金纳米粒子已与核酸适配体充分结合，故最优反应时间选为15 min。

2.2.5 适配体浓度的选择按照检测靶标的反应体系，固定纳米金溶液用量为150 μL，向反应体系加入一系列不同浓度(0、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、3.0 μmol/L)的适配体溶液30 μL，混合均匀，孵育15 min，用30 μL甲醇代替靶标，再向孔中加入30 μL 200 mmol/L NaCl溶液并混合均匀。结果显示，当适配体浓度为2.0 μmol/L时恰好能保护纳米金颗粒在200 mmol/L NaCl溶液下不聚集变蓝。因此，选择最佳适配体浓度为2.0 μmol/L。

2.3 适配体纳米金比色法检测4种有机磷农药

图4 适配体纳米金比色法检测4种有机磷实测图Fig.4 Determination of four organophosphorus spectra by aptamer nanogold colorimetry

本研究所用核酸适配体对甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷、水胺硫磷4种有机磷农药具有高度亲和力，因此，对50、100、200、500、1 000、5 000 μg/L的4种农药进行检测，结果见图4。虽然适配体对4种农药的检测存在一定差异，但当农药质量浓度高于1 000 μg/L时溶液均显蓝色,因此，该方法虽不能对此4种农药残留准确定量，但可用于现场快速筛查，为有机磷农药多残留的快速半定量检测提供了一个新方法。

2.4 特异性检测

实验选择马拉硫磷、辛硫磷、庚虫磷、硫线磷、乐果考察方法的特异性，当检测样品中加入1 000 μg/L的马拉硫磷、辛硫磷、庚虫磷、硫线磷和乐果时，体系的颜色和吸光度值基本无变化；而加入1 000 μg/L甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷和水胺硫磷后，体系变蓝，肉眼可见，吸光度值也有明显变化，表明该适配体传感器对甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷、水胺硫磷4种农药残留具有良好的特异性。

2.5 药材样品的检测

在优化条件下，采用本方法对市售金银花、菊花、槐花、山楂、葛根、干姜、枸杞共21批样品进行检测，结果在毫州的菊花、山东潍坊的山楂和四川的干姜中检出4种有机磷残留量超过1 000 μg/L，其余18批未检出。

3 结 论

本研究建立了一种基于纳米金-适配体同时检测甲拌磷、氧化乐果、丙溴磷、水胺硫磷4种有机磷农药的快速纳米金比色检测方法。该适配体传感器以纳米金为信号传导元件，通过在纳米金粒子表面修饰有机磷适配体，可对4种有机磷农药进行特异性识别。当4种有机磷残留总量超过1 000 μg/L时，溶液体系由红色变为蓝色，适合现场快速检测以及样本的初步筛查，可为有机磷农药多残留的快速检测提供了一种的新思路。