实时直接分析-高分辨质谱法快速检测化妆品中的氯霉素

2020-01-08邵琳智陈思敏

分析测试学报 2019年12期

蓝草，邵琳智*,陈思敏

(1.广州海关技术中心，广东广州 510623；2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东广州 510623)

“爱美之心，人皆有之”。随着现代科技的不断发展，化妆品种类越来越多，人们的日常生活已然离不开化妆品，同时也对化妆品的功效和质量提出了更高要求。某些厂商为使产品具有消炎祛痘等功效，违法添加抗生素、糖皮质激素类化合物。氯霉素是一种广谱抗生素，具有杀菌消炎作用，使用后能明显改善肤质。然而，长期使用则会产生严重的副作用，可引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病,对人类健康构成潜在危害[1-2]。因此，我国《化妆品安全技术规范》[3]规定氯霉素不得作为生产原料及组分添加到化妆品中。目前，检测化妆品中氯霉素的常用方法有高效液相色谱法[2,4-5]和液相色谱-质谱法[1,6-8]，但这些方法的样品前处理复杂、费时，分析时间长、基质干扰较强，易造成色谱和质谱系统的污染，不利于快速筛查。而常用的酶联免疫法、放射免疫法等快速筛查方法则普遍存在假阳性率高、灵敏度低、普适性差等缺点。

“绿色”、“快速”、“无损”、“原位”是分析检测行业新的发展方向，近年来以原位电离技术为主要标志的敞开式离子化质谱(AIMS)得到了迅猛发展。原位电离技术包括实时直接分析(DART)、液滴萃取表面分析(LESA)、高速激光热解析化学电离(LDTD)、电喷雾萃取离子源(EESI)、解吸附电晕束离子源(DCBI)等,其中DART无需或只需简单的样品前处理，具有实时、原位、高通量、简便快速、环保、可与各种质谱仪联用等优点，同时兼具传统质谱的分析速度快、灵敏度高等特点，已被应用于食品药品非法添加、司法鉴定、成分分析等领域[9-14]。静电场轨道阱高分辨质谱(Q-Exactive-Orbitrap-MS)技术在其扫描质量范围内可提供目标化合物的精确质量数，具有质量分辨率高，数据库建立和软件检索方便，样品基质干扰极少，无需设定时间窗口，以及操作便利等优点，在筛查定性、定量分析中具有广泛的前景。

本研究采用实时直接分析-静电场轨道阱高分辨质谱(DART-Q-Exactive-Orbitrap-MS)建立了化妆品中氯霉素的快速检测方法。该方法无需复杂的样品前处理和耗时的色谱分离，减少了对化学溶剂的消耗，大幅缩短了样品分析周期且可避免基质干扰[15-16]。同时，能得到具有精确质量数的准分子离子峰和丰富的碎片离子，能够快速、准确地测定各种基质化妆品中的氯霉素含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Q-Exactive静电场轨道阱质谱仪(美国Thermo Fisher公司)，实时直接分析离子源DART SVP(美国Ion Sense公司)；BT 124S分析天平(德国Sartorius公司)；1-14高速离心机、3-30K高速离心机(德国Sigma公司)，MS3 basic旋涡振荡器(德国 IKA公司)；SW 30H超声波水浴(瑞士SONO SWISS公司)。

氯霉素标准物质(CAS号：56-75-7)的纯度为99.2%，购自德国Dr.E公司；乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇(HPLC级，美国Fisher Scientific公司)；甲酸(HPLC级，德国Merck公司)；所用试剂除注明外均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取氯霉素标准品约25 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成500 mg/L的标准储备溶液。

1.3 样品预处理

称取0.5 g试样(准确至0.01 g)于15 mL离心管中，加入1.0 mL乙醇置于超声波水浴中超声5 min，涡旋振荡10 min，以10 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL转移至1.5 mL塑料离心管中，加入0.5 mL水，涡旋混匀，以10 000 r/min离心5 min，取上清液待测。

1.4 标准曲线的绘制

采用标准加入法，称取0.5 g试样于15 mL离心管中，加入适量标准储备溶液(可逐级稀释)，配制成质量浓度为0、2.0、5.0、10、20、50、100 mg/L的系列标准溶液，放置30 min，按“1.3”进行预处理后，供质谱测定。以测得的色谱峰面积(Y)为纵坐标，对应的标准溶液质量浓度(X，mg/L)为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

1.5 实验条件

DART源条件：负离子模式，离子化气体为高纯氦气，氦气流速为3 L/min，离子化温度为500 ℃；采用12 Dip-it Samplers模式进样，用移液枪吸取1 μL溶液点于玻璃棒下端置于自动进样架上进样，进样速度为0.3 mm/s，离子源出口距质谱进口约10 mm。

质谱条件：负离子化模式；一级全扫描(Full MS)质量范围：m/z100～1 000；分辨率：70 000；吹扫气流速：7 L/min；离子最大容纳数量(AGC target):1×106；离子最大注入时间：100 ms；平行反应监测模式(PRM)扫描分辨率：17 500,离子最大容纳数量:2×105；离子最大注入时间：100 ms。氯霉素母离子：m/z321.005 1,子离子：m/z152.035 5和121.029 4，归一化碰撞能量(NCE)：35 eV。

图1 NCE为35 eV时氯霉素的二级质谱图Fig.1 MS2 spectrum of chloramphenicol in NCE at 35 eV

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

氯霉素分子结构中含有氯离子，在负离子监测模式下灵敏度较高。吸取1 μL氯霉素标准溶液点于玻璃棒下端进行一级全扫描-二级质谱全扫描(Full MS/dd-MS2)模式扫描，考察归一化碰撞能量(NCE)分别为10、20、35、45、60 eV时对氯霉素二级质谱的影响，结果表明在归一化碰撞能量为35 eV时能够得到较好的二级质谱图(如图1)。分别选择响应较高的152.035 5和121.029 4两个子离子作为定量和定性离子进行Full MS-PRM模式扫描。

2.2 DART条件的优化

2.2.1 离子化温度DART离子源需要高温使激发态的惰性气体解析并瞬间离子化待测化合物，因此离子化温度是非常重要的参数。过高和过低的温度均会影响DART的离子化效率和背景噪音，高温会加速待测样品的热解吸率，使更多的待测样品进入质谱检测器，进而增强响应。然而，过高的温度会导致待测样品在热解吸过程中降解，反而降低灵敏度[17]。本研究考察了离子化温度分别为300、400、500 ℃时氯霉素的响应情况，结果表明当离子化温度为500 ℃时氯霉素的响应是400 ℃时的2倍，是300 ℃时的5倍，因此选择离子化温度为500 ℃。

2.2.2 样品传输速度DART软件能控制线性轨道上Dip-it玻璃棒的移动速度，从而控制待测样品在离子化区域的停留时间，因此传输速度对样品的峰形和响应强度有较大影响。本研究考察了传输速度分别为0.3、0.5、1.0 mm/s时氯霉素两对子离子的峰形和离子响应强度，结果表明，样品传输速度越快，目标离子的峰形越尖锐，但当传输速度过快时，离子化气体与样品的接触时间过短，导致离子化效率低，响应降低。由于样品传输速度为0.3 mm/s的响应和0.5 mm/s时差别不大，但扫描点数多于后者，且信号更稳定，定量也更准确，因此选择样品传输速度为0.3 mm/s。

2.2.3 样品溶剂考察了分别以甲醇、乙醇、乙醇-水(1∶1，体积比)和乙醇-0.1%甲酸水溶液(1∶1，体积比)为样品溶剂时对氯霉素响应的影响，结果表明，以乙醇-水(1∶1)为样品溶剂时氯霉素的响应最高，峰形更尖锐，可能是因为水的加入使液滴更不易挥发和扩散，离子化效率好。因此，本研究选用乙醇-水(1∶1)作为上样溶剂。

2.2.4 进样量Dip-it进样模块一般采用蘸取方式，但蘸取进样的重现性较差，因此本方法采用移液枪定量点取的方式进样，分别研究了1 μL和2 μL进样量对氯霉素响应的影响。结果表明，进样量为1 μL时的峰形更尖锐，响应约为2 μL进样量时的3倍，可能是因为2 μL进样量过多，液滴向下流动或向玻璃棒后方扩散，导致峰形扩散，而1 μL进样量能够保证液滴的完整。因此，实验采用移液枪定量点取1 μL样品溶液进样，重现性能够满足实验要求。

2.3 线性关系与定量下限

按照“1.4”方法绘制标准工作曲线，结果显示氯霉素在0～100 mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=8.46×105X-1.36×106，相关系数r=0.998 4。在空白样品中添加氯霉素标准溶液，按照本方法进行测定，以信噪比S/N≥10且回收率和相对标准偏差均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》[18]要求时的质量浓度为定量下限。由于高分辨质谱得到的氯霉素信噪比非常大，因此根据上述规范的要求将本方法的定量下限定为3.0 mg/kg。

2.4 准确度与精密度

采用两个不同品牌的化妆水、面霜、面膜空白样品，分别添加3个水平(3.0、6.0、30 mg/kg)的氯霉素标准溶液，按照本方法进行检测，每个加标水平重复测定6个样品(见表1)。结果表明氯霉素的回收率为70.2%～119%，平均回收率为81.6%～98.6%，相对标准偏差(RSD)为8.4%～17%。