中空纤维膜液相微萃取/高效液相色谱法测定水样中4种头孢菌素的含量

钟佳胜，蒙碧珍，陈振阳，曾环想，周向荣

(国药集团致君(深圳)制药有限公司，广东 深圳 518110)

头孢菌素类抗生素以其抗菌谱广、杀菌力强、耐酸耐酶等优点而被广泛应用于临床，近年来其用量和生产量呈逐年增长趋势[1]。抗生素的滥用、医疗废弃物的随意丢弃以及制药废水的排放，导致水生态环境污染日益严重，在地下水、地表水、再生水、生活污水及城市污水厂出水中均检出痕量的抗生素残留[2-4]。水样中抗生素残留引发的毒性和耐药性等生物安全性问题，已备受人们的广泛关注[5]。

由于水样中头孢菌素的残留浓度水平低，因此在样品分析前需进行富集处理。目前，文献主要以固相萃取(SPE)、液液萃取(LLE)等[6-8]方法进行富集，但存在成本高、需使用大量有机溶剂、富集效果差等缺点。中空纤维膜液相微萃取技术(HF-LPME)以多孔的中空纤维为微萃取溶剂的载体，集采样、萃取和浓缩于一体，溶剂用量少，富集效果良好，是一种环境友好的绿色样品前处理新技术，已被广泛应用于痕量分析物的样品前处理[9-11]。由于HF-LPME较传统液液萃取法的效果更好，因此通常与高效液相色谱法(HPLC)联用即可实现痕量或超痕量分析物的检测。目前，HF-LPME/HPLC技术已被广泛应用于环境、食品、药品等领域的痕量分析，但鲜有应用于头孢菌素的报道。

本文以一代头孢(头孢唑林)、二代头孢(头孢呋辛)、三代头孢(头孢他定)和头霉素类(头孢西丁)抗生素中临床用量较大的4种头孢菌素为研究对象，以离子液体为萃取溶剂，通过优化萃取条件和色谱条件，建立了水样中痕量头孢菌素残留的HF-LPME/HPLC检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配备在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器；PB-10 Sartorius普及型pH计(德国赛多利斯公司)；AB135-S型十万分之一电子天平(瑞士Metter Toledo公司)；LC-DMS-H型恒温磁力搅拌器(力辰科技有限公司)；AccurelQ 3/2聚丙烯中空纤维(壁厚200 μm，孔径0.2 μm，内径600 μm，Membrana GmbH，德国)。

1.2 试药与试剂

头孢唑林(CZO)、头孢呋辛(CXM)、头孢他定(CAZ)和头孢西丁(FOX)对照品购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯)购自美国Fisher Scientific公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Bmin]PF6)、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Hmin]PF6)、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Omin]PF6)和三正辛基氧膦(TOPO)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；醋酸钠、冰醋酸及其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；实验用超纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

1.3 样品制备方法

将中空纤维膜置于丙酮中超声清洗后自然晾干，截取成长度为8 cm的小段，将膜端热封并浸入萃取溶剂(含10%TOPO的[Omin]PF6)中超声2 h。取出中空纤维膜，用超纯水冲洗以去除残留的离子液体。将处理后的中空纤维膜置于10 mL样品溶液(pH 2.5)中，并置于恒温磁力搅拌器中萃取20 min，温度和转速分别设置为30 ℃和600 r/min。取出中空纤维膜并剪开，用50 μL甲醇将接受相吹出并置于液相小瓶配套微量内衬管中，待分析。

1.4 色谱条件

采用Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)色谱柱；以0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(用冰醋酸调至pH 4.0)-乙腈(9∶1，体积比)为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为254 nm；进样体积为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 HF-LPME条件的优化

2.1.1 萃取溶剂的选择由于头孢菌素类化合物的水溶性较强，因此传统有机溶剂对其的萃取效果差。离子液体因具有独特的物理化学性质，萃取效果明显优于传统溶剂，且对有机酸等水溶性强的化合物具有良好的富集效果[12]，因此本实验考察了分别以离子液体[Bmin]PF6、[Hmin]PF6和[Omin]PF6为萃取溶剂时对目标化合物萃取率的影响。结果显示：离子液体的碳链越长，目标化合物的萃取效果越好，其中以[Omin]PF6的萃取效果最好。可能是因为随着碳链的增长离子液体的极性增大，根据相似相溶原理，强极性的头孢菌素类化合物在其中的分配系数越大。因此选择采用[Omin]PF6为萃取溶剂。

图1 TOPO浓度对萃取率的影响Fig.1 Effect of concentration of TOPO on extraction efficiency

图2 样品溶液pH值对萃取率的影响Fig.2 Effect of pH value of sample solution on extraction efficiency

图3 萃取时间对萃取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.2 辅助萃取溶剂的选择由于头孢菌素类化合物的亲水性强，直接采用[Omin]PF6进行萃取的效果一般。据报道，在离子液体中加入TOPO可提高萃取效果，其原理为TOPO可与目标化合物发生氢键作用，从而增大其在离子液体中的分配系数[13]。本实验考察了不同浓度TOPO对目标化合物萃取率的影响，由图1可知：加入TOPO后各目标化合物的萃取率明显提高，当TOPO浓度为10%时趋于稳定，综合考虑萃取效果和成本，选择在离子液体中添加10%的TOPO作为辅助萃取溶剂。

2.1.3 样品溶液pH值的选择CZO、CXM、CAZ和FOX分子的β-内酰胺母核上游离羧基的pKa值分别约为2.5、2.5、1.8和3.5，其在水溶液中主要以离子态存在，根据相似相溶原理，此时萃取效率低。因此，样品溶液需先调节pH值，使目标化合物主要以分子态存在。本实验以硫酸为酸化剂，结合各目标化合物的pKa值，考察了样品溶液的pH值分别为1.5、2.0、2.5、3.0和3.5时对萃取率的影响(见图2)。结果显示：随着pH值的降低，目标化合物的萃取率明显增加，但pH值低于2.5时萃取率反而降低。因此选择以硫酸调节样品溶液的pH值为2.5。

2.1.4 盐浓度的影响在样品溶液中加入适量的盐可以提高萃取效率，这是由于盐析效应使大量的自由离子发生水合作用，导致自由水分子减少，从而促进目标化合物进入萃取溶剂中。本实验考察了加入不同浓度的NaCl和Na2SO4对目标化合物萃取率的影响，结果表明，盐的加入对萃取效率的影响不大，因此选择在样品溶液中不加入盐。

2.1.5 萃取时间的影响目标化合物在样品溶液和萃取溶剂之间达到分配平衡需要一定的时间。随着萃取时间的增加，目标化合物在两者之间的分配通常会趋于平衡，萃取率趋于稳定。本实验考察了萃取时间分别为5、10、15、20、30 min时对目标化合物萃取率的影响，由图3可知，当萃取时间为20 min时，萃取率整体较高且趋于稳定。为兼顾萃取时间和萃取效率，实验选择萃取时间为20 min。

2.1.6 萃取温度的影响提高萃取温度可以加剧分子的运动，增大目标化合物在两相中的扩散系数和扩散速率，从而缩短分配平衡时间，提高萃取效率。考察了不同萃取温度(25、30、35、40、45 ℃)对目标化合物萃取率的影响，结果显示，萃取温度对萃取率的影响较小。考虑到头孢菌素对温度敏感，高温易导致其发生降解，结合环境温度、仪器性能参数，最终选择萃取温度为30 ℃。

2.1.7 搅拌速率的影响搅拌样品溶液可以改善传质过程，加快目标化合物进入萃取溶剂的速度，进而缩短分配平衡时间，提高萃取效率。考察了不同搅拌速率(300、400、500、600、700 r/min)对目标化合物萃取率的影响，结果表明，当搅拌速率为600 r/min时，各目标化合物的萃取率最高，继续提高搅拌速率，萃取效率反而略有下降。因此选择样品溶液的搅拌速率为600 r/min。

2.2 色谱条件的选择

本实验考察了Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)2种色谱柱对4种头孢菌素的分离效果。结果表明：采用填料粒径为5 μm的Inertsil ODS-3色谱柱时，CXM和CZO无法基线分离；而采用填料粒径为2.7 μm的Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱时，4种头孢菌素的分离效果良好，且柱效和分离效率均较高，因此选作本实验的色谱柱。结合文献[14-16]，经过优化发现以0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 4.0)-乙腈(9∶1)为流动相时，4种头孢菌素的分离效果良好，最终确定以其作为流动相。采用所建立的HPLC方法，在7 min内可实现4种头孢菌素的分离检测。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系、检出限与定量下限分别取CZO、CXM、CAZ和FOX对照品适量，精密称定，用水配制成系列质量浓度的混合对照品溶液，按本方法处理和测定。分别以目标物的质量浓度为横坐标(x，ng/mL)，峰面积值为纵坐标(y)，采用最小二乘法进行线性回归分析，并以信噪比(S/N)为3或2时对应的质量浓度作为检出限(LOD)，以信噪比(S/N)为10时对应的质量浓度作为定量下限(LOQ)，结果如表1所示。结果表明，各目标化合物的线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99，检出限为0.2～0.7 ng/mL，定量下限为0.5～2.8 ng/mL，方法灵敏度与固相萃取法相当[17]。

表1 4种头孢菌素的线性关系、检出限及定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of four cephalosporin antibiotics

2.3.2 回收率与相对标准偏差取环境水样(即表3中样品4)分别加入不同浓度的CZO、CXM、CAZ和FOX混合对照品溶液进行回收率实验，每个浓度平行配制6份样品，结果如表2所示。4种头孢菌素的回收率为83.2%～102%，相对标准偏差(RSD)为2.0%～9.8%，表明方法的准确度和重复性良好。

表2 4种头孢菌素的回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations of four cephalosporin antibiotics(n=6)

表3 水样中4种头孢菌素的测定结果Table 3 Determination results of four cephalosporin antibiotics in water ρ/(ng·mL-1)

* no detected

2.4 富集倍数

按照公式E=Co,eq/Ci计算HF-LPME的富集倍数，式中E为富集倍数，Co,eq为经HF-LPME萃取后在萃取溶剂中目标化合物的浓度，Ci为萃取前样品溶液中目标化合物的初始浓度。结果表明，4种头孢菌素的富集倍数为45 ～78倍，表明所建立的HF-LPME法对4种头孢菌素具有良好的富集效果。

图4 样品经HF-LPME处理前(a)和处理后(b)的色谱图Fig.4 Chromatograms of sample before(a) and after(b) HF-LPME treatment

2.5 样品测定

采用所建立的方法对不同来源的水样进行测定，如表3所示。其中，水样1来源于某污水处理厂，水样2来源于污水处理厂出水口，水样3由水样1经实验室新型污水处理技术处理后所得，水样4、水样5和水样6取自公开水域或水系。水样1经HF-LPME处理前后的HPLC色谱图如图4所示。结果表明，所建立的方法能够有效检出水样中的4种头孢菌素残留。经处理后的污水中其残留量显著降低，但在公开水域或水系中仍检出痕量头孢菌素残留。

3 结 论

本文建立了基于中空纤维膜的液相微萃取结合高效液相色谱测定水样中4种头孢菌素含量的分析方法。结果表明，本方法对4种头孢菌素的萃取效果良好，富集倍数达45～78倍，检出限为0.2～0.7 ng/mL，回收率为83.2%～102%，相对标准偏差为2.0%～9.8%。该方法简单高效，绿色环保，灵敏度高，富集能力强，可用于水样中痕量头孢菌素残留的测定。