菊酯类农药代谢物分子印迹荧光传感器的制备及应用

2020-01-08季芯羽于劲松叶寅颖李嘉怡王彦茜

分析测试学报 2019年12期

季芯羽，叶泰，袁敏，曹慧，徐斐，于劲松，任华，叶寅颖，李嘉怡，王彦茜

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

拟除虫菊酯类农药是人工合成的一类新型仿生农药，具有广谱、高效、高环境相容性等特点[1]，近年来，被当作高毒性杀虫剂如有机氯和有机磷杀虫剂的替代品，广泛应用于农业生产中害虫的防控[2]。然而，残留的拟除虫菊酯类农药会损伤人的中枢神经系统，且会对内分泌系统产生干扰[3]。间苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid，3-PBA)与间苯氧基苯甲醛(3-Phenoxybenzaldehyde，3-PBD)是大多数拟除虫菊酯类农药的主要代谢物，因此常通过检测3-PBA或3-PBD来探知拟除虫菊酯类农药的残留情况[4-5]。而相比于3-PBA，3-PBD能在较低水平上诱导人类心脏细胞中的DNA损伤和理化变化[6]，因此对3-PBD的检测更为重要。当前对3-PBD的检测多集中于色谱法[7-8]，其样品前处理步骤繁琐，无法满足3-PBD快速检测的需求。

分子印迹技术(Molecular imprinting technology，MIT)是针对目标分子通过共价或非共价作用构筑有效的印迹空腔，从而实现对目标分子选择性识别的技术[9]，分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)具有良好的物理/化学稳定性、高特异性、低成本、易于制备等优点，因此作为传感器的识别单元得到了广泛应用[10-11]。而量子点(Quantum dots，QDs)与分子印迹相结合的技术，通过将QDs包埋到MIPs内，不仅提高了荧光信号的稳定性，还可利用分子印迹特异性的识别空腔，实现对目标分子的高灵敏、高特异性的快速检测[12]。目前，Mn 掺杂ZnS QDs由于毒性低、制备简便而广泛用于荧光分子印迹技术中[13]。

本文基于Mn掺杂ZnS QDs，以3-PBD为模板分子，采用溶胶-凝胶法成功合成了分子印迹荧光传感器(QDs-MIPs)，基于3-PBD选择性结合于印迹空腔后可猝灭QDs-MIPs荧光的原理，构建了快速检测3-PBD的新方法。此外，基于拟除虫菊酯类农药酶解产物，以氰戊菊酯为模型，验证了该传感器应用于拟除虫菊酯类农药检测的可行性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RF-6000荧光分光光度计(日本岛津仪器公司)；PB-10酸度计(赛多利斯科学仪器公司)；H-1650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；K-Alpha X 射线光电子能谱仪、FT-IR傅立叶红外变换光谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；Smartlab9X射线衍射仪(日本理学株式会社)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Color squid white磁力搅拌器(德国IKA有限公司)；BZF30真空干燥箱(上海博迅有限公司)。

3-PBD(98%)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyl triethoxysilane，APTES)、四乙氧基硅烷(Tetraethyl orthosilicate，TEOS)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷((3-Mercaptopropyl)methyldimethoxysilane，MPTS)、磷酸二氢钠(99%)、磷酸氢二钠(99%)均购自美国西格玛公司；氨水、无水乙醇、甲醇、硫酸锌七水合物(ZnSO4·7H2O)，氯化锰(Ⅱ)四水合物(MnCl2·4H2O)、硫化钠九水合物(Na2S·9H2O)购自上海国药集团化学试剂有限公司；氰戊菊酯、醚菊酯、氯氰菊酯均购于上海农药研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 MPTS包被的Mn掺杂ZnS QDs的合成MPTS包被的Mn掺杂ZnS QDs的合成方法参考Wang等的研究[14]。向烧瓶中加入12.5 mmol ZnSO4·7H2O、1 mmol MnCl2·4H2O和40 mL双蒸水，将混合物室温下于氮气气氛下搅拌10 min后，滴加10 mL含有12.5 mmol Na2S·9H2O的水溶液，并继续搅拌30 min。然后加入10 mL 0.625 mmol MPTS的乙醇溶液，并将混合物于黑暗中搅拌20 h。将得到的MPTS包被的Mn掺杂ZnS QDs离心，并用双蒸水和无水乙醇洗涤3次，然后真空干燥过夜。

1.2.2 QDs-MIPs的制备向烧瓶中加入10 mL 乙醇与19 μL 3-PBD，混合均匀。加入120 μL APTES，搅拌30 min，再加入1 mL TEOS，搅拌5 min。向混合物中加入400 mg MPTS包被的量子点和2 mL 6%的氨水溶液，室温下搅拌16 h。用甲醇洗涤模板后，再用水洗涤3次，然后真空干燥，烘干待用。非分子印迹荧光聚合物(QDs-NIPs)的制备方法同上述方法一致，但不加入模板分子。

1.3 QDs-MIPs荧光响应性能研究

将20 μg QDs-MIPs或QDs-NIPs超声分散于5 mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 8.0，5 mmol/L)中。分别取500 μL QDs-MIPs或QDs-NIPs溶液与500 μL不同浓度的3-PBD(0.3～50 μmol/L)溶液于25 ℃振荡混合8 min，在340 nm激发波长条件下(狭缝宽度10 nm)记录600 nm处的荧光强度。

1.4 氰戊菊酯的测定

有研究显示，羧酸酯酶能够水解拟除虫菊酯类农药[15]，本课题组在之前的工作中采用生物矿化策略制备的猪肝酯酶杂化“纳米花”具有较高的酶活力，并能高效地水解菊酯类农药。猪肝酯酶杂化“纳米花”制备参照课题组前期研究[16]。以氰戊菊酯作为拟除虫菊酯类农药模型，用QDs-MIPs对其浓度进行测定。配制不同浓度的氰戊菊酯(0.5～5 μmol/L)，并与1 mL含2 mg/mL“纳米花”的PBS溶液(pH 8.0，5 mmol/L)混合，45 ℃条件下水解20 min。将水解产物离心，取上清液500 μL与500 μL QDs-MIPs溶液(4 μg/mL)25 ℃混合振荡8 min后测定荧光。

1.5 实际样品的分析

为了验证QDs-MIPs对实际样品的应用能力，分别对梨、大白菜、小麦粉进行加标检测。从上海当地超市购买新鲜的黄金梨，榨汁后依次通过离心、玻璃漏斗过滤和0.2 μm滤膜过滤除去沉淀物，将得到的汁液稀释10倍，调至pH 8.0，进行加标实验；购买新鲜的大白菜，将其用双蒸水-乙腈(体积比9∶1)混合液浸泡30 min后，取浸提液调至pH 8.0，进行加标实验；购买小麦粉，用双蒸水-乙腈(体积比9∶1)混合液浸泡30 min后，取浸提液依次通过离心、0.2 μm滤膜过滤除去悬浮颗粒，将得到的汁液稀释10倍，调至pH 8.0，进行加标实验。

2 结果与讨论

2.1 QDs-MIPs的制备及表征

QDs-MIPs合成过程如图1所示。其中，MPTS既作为量子点合成的稳定剂，又用以形成二氧化硅(SiO2)涂层以稳定量子点的荧光[17]。以合成的MPTS包被的Mn掺杂ZnS QDs为载体，3-PBD为模板，APTES为功能单体，TEOS为交联剂，通过溶胶-凝胶反应形成印迹层，经甲醇洗脱后留下具有特殊印迹空腔的QDs-MIPs。其检测机理是，带有空腔的QDs-MIPs通过非共价相互作用结合目标分子3-PBD，随后QDs导带的电荷转移到3-PBD的最低未占分子轨道上，从而引起QDs-MIPs荧光强度的猝灭。

图1 QDs-MIPs合成原理图Fig.1 Synthesis schematic of the QDs-MIPs

采用X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)对量子点及其印迹聚合物进行表征。QDs及QDs-MIPs的XPS图(图2A)显示出Si2p(103 eV)、S2p(162 eV)、C1s(285 eV)、N1s(399 eV)、O1s(532 eV)、Mn2p(638 eV)、Zn2p(1 021 eV)的强烈信号，证实Mn掺杂ZnS QDs和QDs-MIPs已成功制备。对N1s进行分峰处理，结果见图2B，N1s的XPS光谱中显示两个峰，主峰在399 eV，可归因于N—H结构，较小的峰在～400 eV，可归因于C—N结构。

MPTS包被的Mn掺杂ZnS QDs和QDs-MIPs的X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)图谱(图2C)显示，两者均具有(111)、(220)和(311)晶面，属立方结构(或闪锌矿)。QDs-MIPs(111)面衍射峰的强度弱于ZnS QDs的原因是，QDs-MIPs比ZnS QDs含有更多的无定形材料(SiO2)。

为进一步验证QDs-MIPs的成功合成，对QDs、QDs-MIPs和QDs-MIPs+3-PBD进行红外光谱扫描(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)(图2D)。1 066 cm-1附近的强宽峰为Si—O—Si的不对称拉伸振动，790 cm-1处为Si—O的伸缩振动；2 929 cm-1处脂肪族C—H的拉伸带和3 421 cm-1处的N—H带表明存在氨基丙基，说明APTES成功接枝到MPTS包被的QDs表面;1 486 cm-1附近的峰归因于3-PBD结构中苯环的骨架振动，移除模板后，1 486 cm-1附近的峰值减小，表明在MIPs上获得了特定的识别腔。

2.2 检测条件优化

考察了不同pH值对QDs-MIPs荧光强度变化的影响，结果如图3A所示。pH<8.0时，随着pH值的减小，传感器的响应降低；pH>8.0时，SiO2壳会被电离而导致表面缺陷，使得3-PBD对QDs-MIPs的荧光猝灭明显降低。因此选择pH 8.0进行后续研究。

进一步考察了不同作用时间对QDs-MIPs荧光强度变化的影响，图3B为QDs-MIPs与5 μmol/L 3-PBD作用不同时间的荧光强度变化情况。结果显示，随着作用时间的延长，荧光猝灭值逐渐增大，两者相互作用8 min时QDs-MIPs荧光猝灭值达到平衡。因此，选择8 min作为最佳作用时间。

2.3 QDs-MIPs及QDs-NIPs对3-PBD的荧光响应

在最优条件下，考察了不同浓度3-PBD(0.3～50 μmol/L)对QDs-MIPs荧光强度的影响。随着3-PBD浓度的逐渐增加，QDs-MIPs对3-PBD的特异性吸附增加，其荧光强度逐渐降低。以ΔIF(即IF0-IF)为纵坐标(y)，3-PBD浓度为横坐标(x)作校准曲线，得到线性方程y=21.61x+93.54(r2=0.998)。3-PBD浓度在0.3～5 μmol/L范围内与ΔIF呈良好线性关系，检出限(依据3Sb/K计算，其中K是校准曲线的斜率，Sb是空白标准偏差)为0.267 μmol/L。

同时考察了不同浓度3-PBD(3～50 μmol/L)对QDs-NIPs荧光强度的影响。由于QDs-NIPs不能特异性吸附3-PBD，因此3-PBD浓度较低时，QDs-NIPs的荧光强度几乎重合。随着3-PBD浓度的增加，QDs-NIPs的荧光发生一定程度的猝灭，且3-PBD浓度(x)在10～50 μmol/L范围内与ΔIF(y)呈线性关系，线性方程为y=2.05x+83.55(r2=0.984)。

图4 QDs-MIPs和QDs-NIPs的选择性Fig.4 Selectivity of QDs-MIPs and QDs-NIPs

2.4 QDs-MIPs的特异性研究

为了评价所合成的QDs-MIPs的选择性，以5 μmol/L菊酯类农药醚菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯，烟碱类农药吡虫啉、噻虫啉，有机磷类农药乐果、苯线磷进行荧光响应测定。结果显示(图4)，QDs-MIPs对3-PBD有较强响应能力，对其他拟除虫菊酯类农药也有一定的响应，但对烟碱类农药和有机磷类农药的响应较弱。由于QDs-NIPs上不存在特异性吸附位点，因此对上述物质几乎没有响应。

表1 实际样品的加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations of 3-PBD for spiked samples(n=5)

2.5 氰戊菊酯的测定

本课题组前期研究表明猪肝酯酶杂化“纳米花”能够高效水解菊酯类农药[16]，因此将制备的QDs-MIPs与酶水解相结合，以实现对菊酯类农药的快速检测。以ΔIF为纵坐标(y)，氰戊菊酯浓度(x)为横坐标作校准曲线，得到线性方程y=38.55x+97.79(r2=0.994)。结果显示，氰戊菊酯在0.5～5 μmol/L浓度范围内与ΔIF呈良好线性关系，检出限(依据3Sb/K计算)为0.246 μmol/L(即0.1 mg/kg)。根据GB2763-2016对水果中氰戊菊酯最大残留限量为0.2～1 mg/kg的规定[18]，本方法能满足相关测定需要。