不同预处理方式对鲢鱼肉冷藏品质的影响及其机制

胡维杰，沈韫韬，马 良，戴宏杰，郭 婷，周鸿媛，余 永，张宇昊

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

中国是传统的水产品生产大国，鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）的养殖量和消费量均居我国淡水鱼前列，鲢鱼味甘、性平、无毒，其肉质鲜嫩、营养丰富，深受消费者的喜爱[1]。随着人们生活水平的提高，特别是我国生鲜超市的发展、销售冷链的形成[2]，消费者对鱼肉的需求日益增大，并对其鲜度、安全品质等的要求也越来越高。而水产品肉质相对较嫩，在运输贮藏过程中容易受到机械损伤，导致易受微生物侵蚀，同时在贮藏过程中，鱼肉本身含有的酶也会使鱼肉自溶[3]。因此，淡水鱼肉的保鲜措施必须及时有效。在水产品的保鲜方法上主要集中在两个方面：一是杀灭尽可能多的微生物；二是创造一个不适宜微生物生长同时能降低酶活性的环境[4]。很多学者在这两个方面投入了大量的工作。

在杀灭微生物方面，郭珊珊等[5]研究了臭氧水处理-冰温保鲜对脆肉鲩鱼片品质的影响，采用臭氧水淋洗、冰温贮藏的脆肉皖鱼片贮藏期为14 d，相较于未处理样品延长了9 d；何丽等[6]研究了鲜切草鱼鱼腩的减菌条件优化，经过次氯酸钠处理后的鲜切鱼腩在4 ℃条件下结合气调包装贮藏期可达11 d，贮藏期延长83%。杨茜[7]则研究了超高压对冷藏带鱼段的保鲜效果，超高压能有效抑制微生物生长和总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的上升，压力越高，保压时间越长，抑制效果越明显，但过高的压强使得肉质透明度、持水力下降。另外，在包装技术方面也有大量的相关研究，真空环境、惰性气体和弱酸性气体环境能有效抑制微生物的生长。刘明爽等[8]研究了冷藏和微冻条件下真空包装鲈鱼片的新鲜度，真空包装可以有效抑制微生物生长，同时与低温条件共同作用可以有效延长贮藏期。蒋硕[9]对改性抗菌聚乙烯薄膜进行了研究，0.5 g/100 mL茶多酚和0.5 g/100 mL对羟基苯甲酸乙酯联合1.5 g/100 mL丙酸钙的聚乙烯醇保鲜薄膜对（4±1）℃鳊鱼具有最佳的保鲜效果。奉琳娜[10]应用微冻与气调结合的保鲜技术保藏罗非鱼片的研究说明微冻气调保鲜时，较优的气体比例为50%（体积分数，下同）CO2+40% O2+10% N2，贮藏期可达30 d。汪金林[11]将茶多酚应用于大黄鱼的保鲜、崔生辉等[12]将辐照应用于几种水产品保藏和唐亚丽等[13]将抗菌涂膜应用于鱼类保鲜上的研究都为水产保鲜提供了新的思路和方向。

目前我国鲢鱼主要以活鱼流通和销售为主，近年来随着餐饮模式的改变以及中央厨房的兴起，对半成品配送市场的需求逐年增长，此外大型超市销售的冷藏调制鲢鱼块制品的销售量也在增加[14]，这对于鲢鱼的冷藏保鲜提出了更高的要求。目前鲢鱼保鲜方式主要包括壳聚糖涂膜处理[15-16]、添加茶多酚辅助保鲜[17]等，经过这些方法处理后，在4 ℃冷藏条件下，鲢鱼保质期相对于未处理组可以延长3～5 d，达到1 周左右。在运输和售卖过程中，诸多因素影响半成品及冷藏调制食品的货架期，1 周左右的保质期无法有效满足市场的需要，进一步研发鲢鱼肉保鲜方式对延长其货架期具有实际意义。

本实验以鲢鱼肉为对象，首先研究气调处理、超高压处理、ClO2协同气调与ClO2协同超高压处理等不同预处理方法对其保质期的影响，在此基础上筛选效果最优的两种方式，研究鲢鱼肉预处理后冷藏过程中持水性、蒸煮损失率以及全质构等品质指标变化规律，并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和拉曼光谱研究鲢鱼肉再贮藏过程中结构变化情况，以明确贮藏期间鲢鱼肉品质变化的机制，旨在为鲢鱼鱼肉的保鲜和贮藏提供行之有效的方法并提供初步的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鲢鱼购于重庆市北碚区雄风超市，体长50 cm左右，质量1.5～2.0 kg。

二氧化氯 山东华实药业；氧化镁、硼酸、三氯乙酸、冰乙酸、盐酸、体积分数95%乙醇（分析纯）、平板琼脂培养基、无菌生理盐水（生物制剂）成都市科龙化学试剂厂；Tris、考马斯亮蓝R-250（优级纯） BIO BASIC公司；质量分数30%丙烯酰胺（优级纯） 北京索莱宝科技有限公司；甘氨酸（分析纯） 生工生物工程（上海）有限公司；标准蛋白（分子质量10～200 kDa，分析纯） 加拿大Fermentas公司。

1.2 仪器与设备

Power PacTM基础电泳仪 美国Bio-Rad公司；8002温控水浴锅 北京永光明医疗仪器厂；JA3003B电子天平 上海精天电子仪器有限公司；101-4-S电热恒温培养箱 上海跃进医疗仪器厂；CT-3质构仪 美国博勒飞公司；FSH-2A均质器 上海标模仪器厂；DZ-600-2S真空包装机 双丰仪器制造公司；气调包装机 利强仪器制造厂；DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将新鲜鲢鱼击头宰杀、去头、去内脏，沿脊柱切成两片后剁成多段，取其脊背肉。切成6 cm×4 cm×1 cm左右的鱼块，分组并进行不同的处理，处理后均置于4 ℃的冰箱中冷藏20 d，并分别在冷藏1、5、10、14、15、19、20 d时随机取样。

气调组：将切好的鱼肉分成3 组，各组分别进行不同的气调包装，充气比例为100% CO2、45% N2+55% CO2、75% N2+25% CO2。

气调+ClO2组：将切好的鱼肉分成3 组，各组首先在10 mg/L的ClO2溶液中浸泡40 min[13]，之后分别进行气调包装，充气比例为100% CO2、 45% N2+55% CO2、75% N2+25% CO2。

超高压组：将切好的鱼肉进行真空包装，之后超高压（压强500 MPa；保压120 s）处理。

超高压+ClO2组：将切好的鱼肉首先在10 mg/L的ClO2溶液中浸泡40 min，真空包装后使用超高压处理（压强500 MPa；保压120 s）。

未处理组：将切好的鱼肉直接真空包装。

1.3.2 TVB-N含量的测定

TVB-N含量参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。

1.3.3 菌落总数的测定

菌落总数参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数的测定》进行测定。

1.3.4 持水力的测定

从鱼的背部取白肉，取2 g绞碎后放入离心管中。3 000×g离心5 min后称量鱼肉质量。持水力按照式（1）进行计算。

式中：m1表示离心前鱼肉质量/g；m2表示离心后鱼肉质量/g。

1.3.5 蒸煮损失率的测定

从鱼背部取鱼肉，切成2 cm×2 cm×1 cm的小块，称质量（m3/g），放入蒸煮锅中蒸煮5 min后冷却至室温，用吸水纸吸去表面水分再次称质量（m4/g）。蒸煮损失率按式（2）进行计算。

1.3.6 质构特性的测定

使用CT-3质构仪测定鱼肉的质构特性（硬度、弹性、咀嚼性、内聚性）。质构特性测定参数设置：探头：TA5；测试类型：TPA；测试速率：5 mm/s；触发力：5 g。

1.3.7 SDS-PAGE分析

电泳胶的制备参照杨晖等[18]的方法进行，制备质量分数10%分离胶、5%浓缩胶，按郑红等[19]的方法对样品进行前处理并电泳。用凝胶成像系统拍摄电泳图，再通过Gene Tools软件分析结果。

1.3.8 拉曼光谱分析

使用DRX激光共聚焦显微拉曼光谱仪测定拉曼光谱。激光波长为785 nm，激光能量30 mW，光阑50 μm针孔。记录400～4 000 cm-1的光谱信息。光谱分析中，样品为贮藏期鱼肉。载玻片用锡纸包裹，将少量鱼肉样品放置在载玻片上压平。收集获得的信号使用OMNIC软件处理。

1.4 数据处理与分析

所有实验均重复3 次，结果均以平均值±标准差表示。采用Microsoft Excel 2016软件对数据进行处理分析，SPSS 22软件进行显著性分析（多重比较采用Duncan检验），并用Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对鱼肉贮藏14 d时TVB-N含量及菌落总数的影响

表1 不同处理对鲢鱼肉贮藏14 d时TVB-N含量及菌落总数的影响Table 1 Effects of different pretreatments on TVB-N content and total number of colonies in silver carp meat after storage for 14 d

TVB-N含量和菌落总数是反映鱼类产品腐败程度的两个重要指标，GB 2733—2015《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》要求贮藏期间淡水鱼和虾的TVB-N含量应不超过20 mg/100 g，菌落总数应不超过6（lg（CFU/g））。由表1可知，未处理或者经过单纯气调处理的鲢鱼肉冷藏14 d后均已变质，在TVB-N含量和菌落总数均符合GB 2733—2015的4 组中，有2 组为ClO2协同气调处理，其中以ClO2+100% CO2处理效果最优。另外2 组分别为超高压处理和ClO2协同超高压处理组，二者的保鲜效果并无显著差异（P＞0.05）。因此，从中选出ClO2+100% CO2组与超高压处理组，进一步分析这两种保鲜方式处理后，冷藏过程中鲢鱼肉品质变化及其机制。

2.2 不同处理对鱼肉贮藏期间持水力的影响

图1 鲢鱼鱼肉在贮藏期内持水力的变化Fig. 1 Change of water holding capacity in silver carp meat during storage

持水力表示在一定外力作用下，样品束缚自身或外加水分的能力，是评价鱼肉品质的一个重要指标[20]。如图1所示，总体上，各组样品的持水力随贮藏时间的延长均呈下降趋势。F组持水力下降最为明显，从第1天的93.1%下降到第10天的52.4%，之后逐渐趋于平稳，UF组与QPF组在第10天和第19天的持水力分别为88.5%、77.6%和66.2%、58.6%，显著高于F组（P＜0.05）。贮藏期间，在内源酶与外源微生物的共同作用下，鱼肉蛋白质降解，导致持水力下降，UF组与QPF组持水力下降较缓，可能与微生物的抑制作用有关。与QPF组相比，UF组在贮藏过程中持水力保持得更好，这可能是由于超高压处理后，鱼肉蛋白之间氢键作用增强，导致更多的水分子被包裹[21-22]，此外，超高压作用可以使鱼肉肌纤维与肌丝之间的空间间隙增大，水分具有更大的空间被保留，这也使鱼肉在贮藏过程中水分流失减缓[23]。

2.3 不同处理对鱼肉贮藏期间蒸煮损失率的影响

图2 鲢鱼鱼肉在贮藏期内蒸煮损失率的变化Fig. 2 Change in cooking loss rate in silver carp meat during storage

蒸煮损失主要是蒸煮过程中鱼肉蛋白质聚集，导致水分和部分物质流失所致。如图2所示，随着贮藏时间延长，各组样品的蒸煮损失率均呈现上升趋势，F组蒸煮损失率从第1天的4.5%增加至第5天的28.8%，上升速率较快，第19天达到44.5%；UF组蒸煮损失率第1天为4.3%，而后呈现上升趋势，其值始终显著低于F组（P＜0.05）。这可能是因为一方面超高压具有杀菌作用；另一方面超高压更有利于热诱导过程中肌原纤维蛋白凝胶的快速形成，使蒸煮过程中水分损失减少[24-25]。Yang Huijuan等[26]在对低盐低脂香肠的研究中，发现经400 MPa压强处理后的香肠，蒸煮损失率明显下降。QPF组第1天蒸煮损失率为12.5%，高于F组，可能是因为CO2产生的弱酸性环境对蛋白质的结构稳定性有一定影响，但随着贮藏时间的延长其增速变缓；5 d后，QPF组的蒸煮损失始终显著低于F组（P＜0.05）。原因可能在于QPF处理具有抑菌作用，减少了蛋白质的降解，更好地保持了鱼肉的完整性，降低了鱼肉的蒸煮损失率。

2.4 不同处理对鱼肉贮藏期间质构特性的影响

图3 鲢鱼鱼肉在贮藏期内质构特性的变化Fig. 3 Change in texture properties of silver carp meat during storage

鱼肉质构特性可以反映鱼肉表观品质的变化，硬度表示鱼肉肌肉的紧致程度，内聚性表示鱼肉的黏性，弹性表示鱼肉受压后的回复速率，咀嚼性则表示柔软度和口感[26]。如图3所示，在整个贮藏过程中，鱼肉的硬度、内聚性、咀嚼性呈下降趋势，弹性呈先上升后下降趋势。综合鱼肉贮藏过程中质构特性变化情况，UF组鱼肉质构品质优于F和QPF组，一方面因为超高压对鱼肉的抑菌作用明显，降低了微生物的腐败作用；另一方面，可能因为高压处理后，蛋白分子间形成了更多氢键，使肌束排列更加紧密，鱼肉的质地更加紧实，进而提升了鱼肉的质构特性。QPF组质构特性略优于F组，原因可能在于CO2与ClO2协同抑菌作用下，减缓了微生物对鱼肉的腐败速率。

2.5 不同处理鱼肉在贮藏期内SDS-PAGE分析

图4 鲢鱼鱼肉蛋白在贮藏期内SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of silver carp meat proteins during storage

由图4可知，随着贮藏时间的延长，F组鱼肉的肌球蛋白重链变浅，说明在贮藏过程中肌原纤维蛋白发生了降解。UF组鱼肉在贮藏过程中肌球蛋白重链也发生了明显降解，说明超高压处理并不能使鱼肉中内源酶失活，在刘平等[27]的研究中发现，采用超高压技术（100～600 MPa，20 min）处理胰蛋白酶，500 MPa的超高压处理组胰蛋白酶活性与未处理组无明显差异。QPF组鱼肉肌球蛋白重链并未出现明显变浅，这可能是因为ClO2在一定程度上使内源酶失活，为了验证ClO2对内源酶的抑制作用，将UPF组贮藏过程中的鱼肉进行电泳分析，结果表明肌球蛋白重链条带并未明显变浅，说明ClO2对内源酶活性具有抑制作用。Benarde等[28]采用快速消毒取样法，结合分光光度法和同位素示踪法观察了ClO2对大肠杆菌细胞壁和蛋白质合成的影响后指出，用ClO2处理细菌后其细胞内容物（蛋白质和核酸）没有渗漏出来，说明ClO2没有破坏细胞壁的完整性，而细胞合成蛋白质的过程却明显被抑制，说明ClO2对其内源性酶活性有抑制作用。

2.6 不同处理鱼肉在贮藏期内拉曼光谱分析

图5 不同处理组鲢鱼鱼肉贮藏期内的拉曼光谱图Fig. 5 Raman spectra of silver carp meat with different pretreatments during storage

图5 为不同处理组鲢鱼鱼肉的拉曼光谱图，选取其中特征峰进行分析。被称为费米共振双峰的850 cm-1和830 cm-1处的谱峰是酪氨酸残基对位取代苯的有关振动，采用I850/I830以表征酪氨酸残基的暴露与包埋情况，当I850/I830大于1时，表明酪氨酸残基在蛋白表面是暴露的，其可作为氢键供体或受体而与溶剂水分子相互作用；当比值为0.7～1.0时，说明酪氨酸残基包埋在蛋白分子内部疏水环境中，可以作为氧键供体[29-30]。

通过比较I850/I830，发现F组从第1天的1.04降至第15天的0.85，QPF组从第1天的1.09降至0.92，说明随着贮藏时间的延长，酪氨酸残基由暴露转向包埋到疏水环境中，蛋白疏水性增强，与水的氢键作用减弱。UF组从第1天的1.19降至第20天的1.01，说明超高压处理对酪氨酸残基的包埋具有抑制作用，进而抑制了蛋白疏水性的增加，UF组鱼肉在货架期间酪氨酸残基始终处于亲水微环境中，有利于蛋白中鱼肉与水的氢键结合，这赋予了UF组样品在货架期内更好的持水性与质构特性[31]。

位于1 600～1 700 cm-1范围的酰胺I带与蛋白质骨架构象类型相关，其主要涉及肽链C＝O伸缩振动和N—H平面弯曲振动等。α螺旋集中于1 650～1 658 cm-1，β折叠集中于1 610～1 640 cm-1，β转角集中于1 660～1 700 cm-1，无规卷曲集中于1 640～1 650 cm-1。

图6 鲢鱼鱼肉贮藏期内蛋白质二级结构相对含量Fig. 6 Relative contents of secondary structures in silver carp meat during storage

如图6所示，随着贮藏时间的延长，F组α螺旋含量呈降低趋势，无规卷曲含量呈增加趋势，这表明鱼肉蛋白在贮藏过程中结构展开，逐渐呈现无序化[32]。相对于F组，UF组第1天鱼肉α螺旋含量较低，而后随贮藏时间（1～15 d）的延长逐渐增加，15 d后呈下降趋势，这表明超高压处理作用后鱼肉蛋白结构展开，在随后贮藏过程中逐渐呈现有序化，证明了超高压处理促进鱼肉体系中新的氢键形成，使蛋白质结构呈现有序化，而贮藏约20 d后鱼肉蛋白重新表现为展开，这可能与微生物的繁殖有关。QPF组在整个贮藏过程中无规卷曲含量都很低，说明其蛋白质结构较F组始终保持更加有序的状态，原因是ClO2在一定程度上使内源酶失活，保持了蛋白质结构的完整性。

综合电泳与拉曼光谱结果分析，两种保鲜方式除了均有抑菌作用外，对抑制产品劣化的原因有所不同，UF组鱼肉品质的改善与鱼肉中新的氢键的形成有关，QPF组中ClO2主要对鱼肉中的内源酶活性起抑制作用，更好地保持了蛋白结构的完整性，从而改善鱼肉的品质特性。

3 结 论

ClO2+100% CO2气调处理和超高压处理的效果最好，能使鲢鱼冷藏14 d以上。与未处理组相比，超高压、气调协同ClO2（ClO2+100% CO2）处理后鱼肉冷藏过程中持水力提高，蒸煮损失率降低，质构品质提高。原因在于超高压的杀菌作用以及超高压处理促进鱼肉体系中新的氢键的形成，使蛋白质结构更加有序化；而ClO2+100% CO2处理抑制了微生物的快速生长和鱼肉的内源酶活性，使贮藏过程中鱼肉蛋白质降解程度降低，从而改善了鱼肉的品质特性。