血清标志物在肝癌早期诊断中的研究进展

王冰洁，张佳光，杨婧

三峡大学第三临床医学院国药葛洲坝中心医院感染性疾病科，湖北 宜昌 443002

我国原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)发病原因以病毒性肝炎多见，乙型肝炎病毒(HBV)感染相关性肝癌尤为严重，酒精、黄曲霉素等也是我国PHC 发病的重要原因。肥胖、糖尿病、代谢综合征及非酒精性脂肪肝等导致肝癌发生的风险也日益增加。肝癌发病隐匿、进展迅速，患者就诊时往往已在中晚期，甚至失去手术根治切除机会，因此，对肝癌的早发现、早诊断可以很大程度上提高肝癌患者的生存期。

1 肝细胞癌流行现状

根据2018年全球癌症统计报告数据，全球新增肝癌占全球癌症发病和死亡的4.7%和8.2%，男性患病明显高于女性，肝癌的发病率和死亡率分居全球癌症发病和死亡的第6 位和第4 位，居中国癌症发病和死亡的第4位和第3位[1]。

肝硬化、肝炎病毒感染、嗜酒、黄曲霉素暴露是肝癌发生的主要危险因素，HBV感染仍是我国肝癌发生的主要原因。HBV感染具有直接致癌的作用，其机制包括病毒载量、病毒的持续感染、隐匿HBV 感染等，HBV与HIV或HCV的联合感染也会增加罹患肝癌的危险性。非酒精性脂肪肝、糖尿病、肥胖等致病因素也日益突出，其实际风险尚不明确[2]。目前主张对肝癌高危人群进行每6 个月一次甲胎蛋白(AFP)检测及肝脏超声，但超声结果受操作者水平及患者体型的影响，对于直径小于1 cm的小肝癌容易漏诊；另一方面，存在30%～40%肝癌人群AFP阴性，达不到肝癌诊断标准[3]。因此，为探索出更适合肝癌筛查的血清肿瘤标志物及方案成为国内外广泛关注的问题。

2 AFP阴性肝癌

AFP是一种分子量约为70 kDa的糖蛋白，由卵黄囊和肝脏产生。肝细胞发生癌变后，由于低甲基化作用使AFP 基因激活并表达，表现为AFP 阳性肝癌。AFP基因的表达受不同因素调控，有时会导致部分肝癌患者AFP 不表达或直到晚期也始终保持低水平(血清AFP 浓度<200 ng/mL)，称之为AFP 阴性肝癌。临床表现多以右上腹痛为主，肝功能损害较轻，全身衰竭较晚，乙肝表面抗原阳性率及合并肝硬化者较少。通过比较AFP 阴性与阳性肝癌组织mRNA 表达谱的差异性，AFP阴性肝癌高表达基因主要参与细胞凋亡和程序性死亡，而AFP阳性的高表达基因则主要参与有丝分裂和细胞周期等过程[4]。这提示在不同AFP水平的肝癌在发生和发展存在不同的分子机制，在分子领域的深入研究有助于发现AFP 阴性肝癌早期诊断的分子标志物和肝癌治疗的新靶点。

3 主要肝细胞癌诊断相关血清标志物

3.1 AFP 异质体(AFP-L3)及与血清总的AFP 比值(AFP-L3%) 1970 年Parves 发现PHC 患者血清中唾液酸含量不同，从而提出AFP异质体(AFP-L3)的概念。AFP 不同的糖残基(AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3)决定了它们与凝集素的结合能力，当肝细胞发生癌变时，AFP 的糖残基发生岩澡糖基化，表现出与小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin，LCA)不同程度的亲和性，以AFP-L3 亲和性最强。AFP-L3 仅由肝癌细胞产生，其水平升高仅见于PHC患者[5]。AFP-L3与血清总的AFP比值(AFP-L3%)是小肝癌和早期肝癌诊断的高特异性指标，还可以反映肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的恶性特征，如门脉浸润和肿瘤低分化等[6]。FDA 早在2005 年批准检测AFP-L3 应用于肝癌诊断，并把AFP-L3%≥10%作为诊断肝细胞癌的阳性界定[7]。AFP-L3%是独立于AFP 的肝癌诊断因子，不受血清总AFP水平和半衰期影响，在AFP不升高的情况下，有34.3%的原发性肝癌患者在确诊1 年前即出现AFP-L3%升高[8]。AFP-L3%也是肝癌复发的独立预测指标，术前AFP-L3%>10%、术后AFP-L3 持续阳性或由阴性转为阳性的患者复发较早且总生存率更低[6]。现阶段国内检测AFP-L3 的方法主要为亲和吸附离心法，需手工操作，步骤繁琐、耗时、成本高且重复性较差；微流控免疫荧光法实现了自动化检测，但国内应用较少，尚缺乏足够的临床经验和数据[7]。

3.2 异常凝血酶原(DCP/PIVKAⅡ) LIEBMAN于1984 年首次证实PHC 患者血中含有较高的异常凝血酶原(des-γ-carboxyprothrombin，DCP)，现也称维生素K 缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质(PIVKAⅡ)[9]。在正常人体内，凝血酶原前体形成具有正常凝血功能的凝血酶原被认为是其谷氨酸残基(Glu)羧化成为γ-羧化谷氨酸(Gla)的过程，少于10 个Glu 未转化为Gla 的凝血酶原前体即成为DCP 从而失去正常凝血功能[9]。研究发现DCP 通过激活DCP-Met-JAK1-STAT3 信号传导途径刺激HCC生长；通过激活基质金属蛋白酶和ERK1/2MAPK 通路增加HCC 的侵袭和转移；并具有促进血管生成的作用，有望成为一种新的血管生成因子[9]。 日本肝病学会(Japan Society of Hepatology，JSH)制定的肝癌诊疗指南中建议，将AFP、AFP-L3 和DCP 同时作为肝癌筛查的标志物[3]。有研究显示在HCC 患者中DCP 水平显著升高，有利于区分慢性肝病、肝硬化等良性疾病[10]。DCP与AFP作用机制相互独立，在诊断肝癌上存在差异，对AFP 阴性肝癌灵敏度高[11]。其优点包括高于AFP 的特异性；在体内的半衰期更短能更及时反映治疗效果因此可用于HCC 术后复发的监测。但DCP水平与肿瘤直径呈正相关，不推荐作为肝癌筛查和诊断的独立指标，需与其他肿瘤标志物联合检测[12]。在特定因素(如VitK 缺乏的胆管病、华法林摄入、长期阻塞性黄斑及一些抗生素等)下DCP的值也会升高，干扰了DCP对原发性肝癌的诊断。

3.3 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypicans-3，GPC3) GPC3是蛋白聚糖家族成员之一，通常在胎儿及HCC 患者肝脏组织中检出，而健康成人、肝炎及肝硬化患者血清及组织中无明显表达[13]。GPC3 通过乙酰肝素链(HS链)稳定和促进Wnt及其受体Frizzled间的相互作用，并与FGF2受体结合促进FGF信号传导，调节肝癌的发生和生长；另外，GPC3可能通过对上皮-间质转化(TAM)功能的影响促进HCC发展和转移，其过表达将导致侵袭的发生，提示预后不良[14]。有研究提示GPC3 对于直径小于2 cm 的肝癌、AFP 阴性肝癌灵敏度较高[12]。但一项荟萃分析指出GPC3在肝硬化和肝癌患者中特异性不如AFP，灵敏度相似，推荐两者联合检测[15]。随着靶向GPC3 分子成像技术的发展，有望应用于肝癌治疗前的定位与分期、术中手术切缘的确定以及术后疗效监测。近年来GPC3的单克隆抗体、肽疫苗和DNA疫苗的研发为肝癌靶向治疗提供精确靶点；相关的免疫毒素治疗利用抗体诱导的细胞信号失活和毒素诱导的蛋白质合成抑制以促进肿瘤细胞的消亡，大大提高了肝癌化疗的安全性和功效性[16]，在肝癌治疗上具有更好前景。

3.4 高尔基体糖蛋白(GP73) 在正常肝脏中GP73 几乎只少量表达于汇管区的胆管上皮，当发生肝脏疾患如病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化及肝癌时可特异性表达，尤以结缔组织周围及肝硬化结节处最强。Marrero 通过蛋白质印迹技术分析352 例肝癌患者血清，发现GP73 诊断肝癌的灵敏度 与 特 异 度 均 超 过70%( 约 为AFP 的2.5 倍)，在AFP<20 ng /L 的肝癌患者中，超过半数人群GP73 明显升高，这提示GP73 在AFP 水平升高不明显或不升高的情况下更有价值[17]。我国学者毛一雷的一项包含4 217 名研究对象的多中心研究同样证实了这一观点，并提出与AFP 联合检测能大大提高肝癌检出率[18]。但近些年GP73 用于诊断肝癌存在争议，研究指出血清GP73 可以反映急慢性肝病炎症坏死程度，与肝纤维化分期更密切[19]。LIU 等[20]的研究发现合并肝硬化的肝癌患者血清GP73 水平升高，而无肝硬化的肝癌患者不升高；在根治性切除肿瘤组织后血清AFP 水平下降而GP73 水平保持稳定，从而提出GP73主要表达于肝硬化组织中而与HCC无关，不适合肝癌的诊断。此外，GP73 可反映肝细胞恶性转化过程中的动态变化，随肝组织形态学的改变，肝组织及血清GP73 呈上升趋势，其表达水平与肝癌分期平行，表达水平越高患者总生存期越短[21]。血清GP73水平变化与肝损伤严重程度正相关，是识别肝脏损伤的敏感指标，在多种良性肝病中存在不同程度升高，因此在鉴别肝脏良恶性病变上作用有限。

3.5 α-L-岩藻糖苷酶(α-l-fucosidase，AFU) AFU是一种水解岩藻糖蛋白的溶酶体酶，存在于所有哺乳动物细胞中。DEUGNIER 首次报道了AFU 在原发性肝癌患者血清中过表达，提示AFU可能是肝癌早期诊断的潜在标志物，诊断的敏感性为70.7%～94.0%，特异性为37.0%～84.0%[12]，其活性明显高于继发性肝癌及肝硬化患者。另外，血清AFU水平与肝癌细胞直径呈正相关，在小肝癌或AFP阴性肝癌中表达更加突出，且与AFP 阳性率无明显相关性[22]，可作为AFP 诊断早期肝癌的有效补充。但在糖尿病、胰腺炎、甲状腺功能减低症时也会有一定程度的升高[23]，因此特异性不高，一般需要与其他标志物联合检测。有研究表明原发性肝癌患者术后血清AFU水平明显下降[24]，这提示AFU还可用于肝癌术后的疗效监测，是独立的预后指标。

3.6 骨桥蛋白(osteopontin，OPN) 骨桥蛋白是一种具有多种生物活性的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，主要参与整合素介导的细胞信号转导，在结肠癌、胰腺癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞的致癌过程中发挥重要作用[25]。OPN 的表达水平与HCC 临床病理特点密切相关，如包膜浸润、血管侵犯、淋巴结转移及临床分期。一些针对不同国家的大样本病例对照研究显示OPN单独或联合AFP诊断HCC的结果可能存在地区差异，需要更多前瞻性研究验证OPN作为肝癌血清标志物的可行性[12]。研究表明HCC 患者中OPN 水平明显高于肝炎或肝硬化患者，且OPN对病毒性肝炎相关HCC具有较高诊断价值，因此更适合应用于我国肝癌人群[26]。血清OPN 在直径小于2 cm 及AFP 阴性肝癌患者中显著升高[27]。另外，OPN可能在预测肝癌患者预后方面的优势更突出，其表达可能与肿瘤包膜的完整性有关，促进肝内浸润、肝外转移及肝癌复发，但具体机制尚未明确[27]。一项大样本Meta 分析指出OPN 与肿瘤大小、分期呈正相关，其高水平表达往往提示预后不良，总生存时间和无病生存期更短[28]。联合血管内皮生长因子可作为预测肝癌术后复发转移的潜在指标[27]。

3.7 分泌型糖蛋白(DKK1) DKK1 是一种分泌型蛋白，能在血清中检测到，通过结合细胞表面受体从而抑制经典Wnt信号通路，而这一信号通路是包括肝癌在内的大多数肿瘤发生发展的重要机制[29]。DKK1 在不同肿瘤组织中存在差异性表达，尤其在肝癌、肺癌、宫颈癌等肿瘤中表达显著[30]。对早期和直径<2 cm 的小肝癌诊断优于AFP，在AFP 阴性肝癌中其诊断的特异性为90%、敏感性为70.4%，与AFP联合检测可将敏感性提高到88%[31]。说明DKK1 可以降低早期肝癌、小肝癌及AFP阴性肝癌的漏诊率，同时，较高的特异性对鉴别肝脏良恶性病变帮助很大；利用DKK1进行联合检测可以作为AFP的有效补充。

3.8 微循环RNA (miRNA) 微循环RNA (miRNA)是一种小型非编码RNA，以外泌体、蛋白结合微粒和凋亡小体的方式存在人体体液循环中，其主要功能是降解目的基因的mRNA，从而调控靶向基因的表达，在肝癌发生发展过程中存在多种miRNA 的异常表达。已知文献报道中，与肝癌有关的异常表达的miRNAs 就有200 余种，其中miR-1、miR-16、let-7f、miR-21、miR-24-3p、miR-122、miR-139、miR-215、miR-221、miR-222这10种miRNA可以作为肝癌早期诊断的生物标志物，以miR21与miR-122的潜能最大[32]。研究表明miR-122表达降低可导致肝纤维化失代偿，增加肝癌发生风险，其表达变化与乙型肝炎病毒DNA水平显著相关，提示miR-122不仅有利于我国肝癌的早期诊断也可以作为肝癌治疗的有效靶点[33]。有文献指出miRNA 在血液中不容易被内源性RNA 酶降解，能稳定存在于血液中[34]，这一特性表明miRNA具有成为生物标记物可能，且miRNA 获取方便，几乎可以在人体所有体液(唾液、尿液、血液等)中分离得到，患者接受度高[33]。但是miRNA调控基因表达上复杂多样，一种miRNA参与多种基因的表达，每一种目的基因的表达又受到一种或多种miRNA的靶向调控，其交叉调控机制使得寻找与肝癌相关的特异性miRNA 极具挑战。目前miRNA 与肝癌作用关系及机制尚未完全阐明，联合多种miRNA 能增加肝癌诊断能力，但需要选择合适的组合，仍需大量研究数据。

4 结语

综上所述，血清学标志物检测费用相对低廉，便于筛查及重复检测，寻找能够替代或有效补充AFP早期诊断原发性肝癌的血清学标志物仍是目前研究主流。但仍存在这些问题：(1)未新发现可单独用于筛查PHC 的血清学标志物，需依赖多项标志物联合检测，但究竟怎样的组合作为筛查指标仍没有定论；(2)目前我国的研究多是小样本、单中心的研究，缺乏更多的数据支持及临床验证；(3)一些标志物存在特定的检测阈值，而不同的检测试剂和方法对检测结果存在偏倚；(4)由于国家在肝炎防治上的有效举措，现阶段我国病毒性肝炎发病率逐年下降，但肝癌发生的危险因素越来越多，需要更多基础研究指导临床标志物的选择。除血清学标志物外，我国在免疫组化、miRNA 方面的研究也逐步深入并取得有效成果，相信随着蛋白组学、基因组学、分子病理流行病学及信息工程等的发展，更加经济、方便且准确性高的筛查方案能更早应用于临床。