层黏连蛋白在耐药性癫痫苔藓纤维发芽发生发展中的作用

石涌霏 王丽琨 伍国锋

目前癫痫的治疗以药物为主，大多数癫痫患者经单一或联合用药足疗程、足剂量治疗后发作可得到控制，但仍有约30%的患者频繁发作，表现为反复性癫痫发作[1]。反复发作给患者心理、认知等方面带来严重负面影响，同时也增加了病死率。耐药性癫痫是指每个月至少4次的频繁癫痫发作，经2种以上的一线抗癫痫药物正规治疗2年以上，仍不能有效改善，排除中枢神经系统进行性病变或占位[2]。耐药性颞叶癫痫是成人最常见的局灶性癫痫综合征，目前病因尚不明确[3]。反复癫痫发作患者存在海马进行性硬化，齿状回苔藓纤维(mossy fiber，MF)异常出芽，从而产生异位突触联系和回返兴奋环路，引起癫痫的反复自发性发作[4-5]。而神经元轴突的生长有赖于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的引导与促进，研究发现耐药性癫痫患者的海马区域存在层黏连蛋白高表达现象[6]。层黏连蛋白具有调节神经元黏附、迁移与生长的作用，与齿状回苔藓纤维发芽(mossy fiber sprouting，MFS)及异常兴奋环路的产生密切相关[7]。现就层黏连蛋白在耐药性癫痫MFS发生、发展中作用的研究现状做一综述。

1 耐药性癫痫的临床病理特征

1.1 海马硬化以海马区星形胶质细胞增生、神经细胞丢失、颗粒细胞散布和MFS为特征，是耐药性颞叶癫痫最常见的病理类型。海马是边缘系统的一部分，与记忆、学习、情感、老化等有关，海马不同结构区域的功能不同，对神经系统的损害性也不相同。根据2013年国际抗癫痫联盟(the international league against epilepsy，ILAE)确定的海马硬化分类标准分为3型：1型是指严重的神经细胞丢失和CA1、CA4区的胶质细胞增生，此型CA1区最为严重，约80%神经细胞丢失[8]；2型以CA1区为主的神经细胞丢失和神经胶质增生；3型是以CA4区为主的神经细胞损失和神经胶质增生，此型较少见[9]。在所有的海马硬化类型中，齿状回的组织学模式是可变的，主要为颗粒细胞的丢失和分散[10]。颗粒细胞的迁移和轴突的重组被称为颗粒细胞分散(granular cell dispersion，GCD)和MFS，刺激MF可诱导齿状回颗粒细胞层的复发性跨突触活动，表明海马硬化中MF的轴突出芽也参与致痫机制[11]。

1.2 MFSMF是海马齿状回颗粒细胞的轴突，在正常情况下，MF的投射具有方向性和特异性，大多投射至海马门区的中间神经元和同一板层CA3区的锥体细胞，不会折返至齿状回分子层，也不会向邻近的板层纵向延伸。而在耐药性癫痫患者及动物癫痫模型脑组织中，经痫性损伤后的海马门区神经元和CA3区锥体细胞大量脱失、死亡，分子层失神经传入，颗粒细胞失去投射目标。MF即发出侧枝折返进入齿状回分子层，与颗粒细胞形成异常的突触联系，产生神经网络的重组，形成兴奋性环路。电生理学实验已证实兴奋性环路的存在[12]，且导致颞叶海马颗粒细胞MF存在轴突出芽现象，进而形成MFS。

MFS是一种异常的神经再生、突触重构的过程，与耐药性癫痫的发生、进展密切相关[13]。研究显示，成年大鼠海马结构受到痫性损伤后可发生MFS现象[14]，耐药性癫痫患者海马齿状回存在由MFS造成的异常轴突长出、突触重建现象[15]。目前有学者认为MFS可导致癫痫频繁发作，从而引起耐药性癫痫的发生。有研究者应用光遗传学方法选择性激活发芽的MF轴突，发芽的MF能够驱动齿状回颗粒细胞突触后动作电位的激活，并在无人为干扰下启动周期性的回路活动，从而提高齿状回细胞兴奋性[16]。由于兴奋性环路的正反馈作用，一方面可降低颗粒细胞电活动的阈值，增加癫痫发作的敏感性，导致癫痫的长期自发性发作；另一方面，由于异常神经冲动在再生环路中不断重复、增强、级联放大，并进一步扩散，引起癫痫大发作。而反复发作的异常神经电活动将不断地刺激神经细胞和神经胶质细胞，导致神经细胞损伤，促进胶质细胞增生和突触重塑，反过来又会加重癫痫的慢性反复发作。颞叶癫痫大鼠随着每一次癫痫的发作，其发作活动会呈逐渐增强趋势，同时伴有更明显的MFS现象，验证了上述理论[17]。

目前，亦有研究认为MFS可能诱导抑制性神经环路，具有抗癫痫作用。MFS可能是海马CA3和CA4区神经细胞死亡的补偿现象[18]。虽然在癫痫发作的动物身上，通过硫化银染法在海马齿状回可观察到MFS，但超微结构分析未显示齿状分子层兴奋性突触数量增加。MFS与突触的替换有关，而非增加突触的兴奋性。所以该作者认为MFS与突触缺失、替换或恢复有关，是一种修复机制。MFS可能既不诱发癫痫也不具有抗癫痫作用，与海马兴奋性回路的增强无关[19]。Cho等有选择性的用海马区新生颗粒细胞来评估MF在癫痫中的作用，在转基因小鼠颗粒细胞祖细胞中产生了胸苷激酶，在癫痫模型中阻断神经元时，可降低自发性癫痫的发作频率，但对MFS的程度无影响[20]。利用匹罗卡品癫痫模型的研究发现，于癫痫发生几天或几个月后，使用白喉毒素受体干预可使新生颗粒细胞凋亡，癫痫发作发生率降低约50%，但MF发芽率均未降低[21-22]。也有研究发现，阻断MFS对癫痫发作无影响，而对MFS无影响的治疗可降低癫痫发作频率[23]。所以目前关于MFS是否在调节癫痫发作中发挥重要作用尚无统一结论。

2 层黏连蛋白的结构与功能

层黏连蛋白是一类基底膜特有的非胶原性糖蛋白，为ECM的主要成分之一，在中枢神经系统内分布范围非常广泛，调节神经细胞的多种生物学功能[24]。层黏连蛋白属于整合素家族，相对分子量约为900 000，由α、β、γ 3条肽链组成，是一种重要的细胞黏附分子。层黏连蛋白的典型结构呈现出由3条肽链螺旋缠绕构成的T形或十字形，即有1条长臂和2～3条短臂。长臂由3条肽链C末端共同组成，短臂由α、β、γ链的N端分别构成。迄今为止共发现16种结构不同但生物学功能相似的层黏连蛋白亚型，其功能结构域高度保守，主要通过α链的球状结构域与细胞表面的整合素受体结合，调控细胞的黏附和迁移[25]。

整合素主要表达于脑脊膜、室管膜、小脑、垂体、海马、松果体等部位的神经胶质细胞和内皮细胞。层黏连蛋白和整合素受体特异性结合后介导胞内信号传递，通过升高细胞质内Ca2+浓度，激活钙调蛋白相关性蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK-Ⅱ)途径[26-27]；同时整合素胞外片段能识别层黏连蛋白分子C端Arg-Gly-Asp-Ser(RGAS)序列，促进神经元轴突黏附在ECM上，并在整合素胞内片段与细胞骨架的相互作用下，使神经元轴突定向延伸，在神经元生长、迁移和突触重塑中发挥着重要作用[28]。

3 层黏连蛋白在MFS过程中的作用

目前研究证实层黏连蛋白在耐药性颞叶癫痫MFS过程中发挥重要作用。在正常情况下，成年蛙中枢神经系统中层黏连蛋白低表达或不表达，其表达增多则为异常现象[29]；而难治性癫痫患者海马组织与血清中层黏连蛋白高表达[6]；且伴有神经元形态学的改变，并存在异常神经元网络，提示层黏连蛋白可能是难治性癫痫形成异常神经网络的基础[30]， 实验性癫痫状态发生后，海马组织发生血管源性水肿，层黏连蛋白表达增加，其表达增加有利于促进星形胶质细胞转移至受损区域或新生血管，从而修复血-脑脊液屏障[31]，但亦可导致轴突的异常生长。

层黏连蛋白是突触基底层中重要组分之一，是一种轴突生长促进因子，具有促进神经元轴突生长的功能，在轴突再生过程中占重要地位，能够支持轴突的生长和结构重塑。更重要的是其可以促进生长锥异常生长，与轴突异常生长密切相关，为癫痫反复发作提供了物质基础，是MF出芽过程中的重要因素。反复的癫痫发作会导致齿状回轴突异常生长，促进MF侧枝出芽产生新的突触联系，然而该异常的突触会导致一个正反馈系统的形成，增高齿状回颗粒细胞的兴奋性，产生一个“兴奋性环路”，进而引起慢性自发性癫痫的产生。层黏连蛋白β1的α链羧基末端序列所衍生的一种由19个氨基酸残基所组成的多肽片段，具有促进神经元轴突生长的功能[32]。层黏连蛋白β1能够促进轴突的生长是因为神经轴突前端的生长锥存在着能与层黏连蛋白β1功能基因相结合的受体，当受体通过与这些功能基团结合后，受体通过微管、微丝调节神经细胞内的肌球蛋白、肌动蛋白进而调节生长锥的形态和细胞骨架的动力，促进神经轴突向外生长。层黏连蛋白-整合素系统广泛参与神经系统中细胞内外机械信号和生化信号的传导，是神经纤维生长的效应分子，也是MFS的可能机制之一[33]。

癫痫的反复异常放电造成神经元的累积性损伤，刺激局部脑组织的反应性胶质细胞增生，促进神经生长因子和细胞黏附分子的表达。反复癫痫发作将上调层黏连蛋白的表达与活性，其α链C末端的功能结构域能促进神经元轴突生长[34]。层黏连蛋白之所以能够促进轴突生长，是因为其受体整合素在特异性活化后，一方面通过钙离子通道，使细胞质内Ca2+浓度增加，从而激活CaMK-Ⅱ，调节神经细胞内的肌动蛋白丝，改变细胞骨架结构，使细胞沿着ECM中黏附分子的浓度梯度定向迁移，从而诱导MF侧枝出芽[35]。

4 总结与展望

耐药性癫痫发作与海马区域异常的神经元环路及突触联系有关。海马结构中，齿状回MFS被认为是耐药性癫痫的病理基础，轴突出芽是神经系统胚胎发育必要条件，但在成年后不应发生。MFS与颗粒细胞之间形成的异位突触及折返兴奋环路是诱发癫痫反复发作的重要病理改变，也是终止与治疗耐药性癫痫的潜在靶点。MFS的产生原因目前尚不清楚，普遍认为神经细胞脱失和反复癫痫发作是促使轴突出芽的两大因素。轴突出芽所致兴奋性异常网络的形成又增加冲动信号回返海马区域的概率，反过来加重了癫痫病情。

MFS的分子机制十分复杂，神经细胞外环境中的介导信号在突触生长过程中扮演不可或缺的角色。随着“神经网络学说”的发展，ECM的作用越来越受到重视。其中层黏连蛋白可以与轴突表面的整合素受体结合，通过信号转导调节细胞骨架系统，介导神经纤维定向生长。在耐药性癫痫患者脑组织中，层黏连蛋白表达上调，引起神经纤维异常迁移，逐步形成兴奋性神经网络。

耐药性癫痫的发病机制及防治手段仍是当下临床的一大难题。层黏连蛋白-整合素系统既具有信号传导功能又具有运动功能，与MFS密切相关，是难治性癫痫发病与进展的分子生物学基础。层黏连蛋白与耐药性癫痫之间的研究可为今后的临床诊治提供一定的理论依据，因此还有待进一步深入探索。