人类诱导多能干细胞在帕金森病治疗中的研究进展

甄隽颖， 郑晓丹综述， 吴 军审校

帕金森病(PD)是继阿尔茨海默症(AD)后第二大常见的神经退行性疾病，多由脑内产生多巴胺的细胞受损或凋亡引起，好发于 60 岁以上的老年人，成为继肿瘤和心血管疾病之后威胁老年人身心健康的第三大杀手。据统计，目前全球约 1000 万老年人遭受 PD 的影响，每年对于该病的护理和治疗费用高达 570 亿美元，而这一数值还在持续上升。PD临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征[1]，目前仍没有根治的治疗手段。近年来，干细胞如人类胚胎干细胞(hESCs)、骨髓间充质干细胞、多能干细胞(iPSCs)等等[2]，为PD的研究和治疗带来了新的希望。干细胞不仅可利用神经退行性疾病的模型探索其发病机制并筛选潜在的药物，而且细胞替代治疗有望成为新的治疗方式。然而，有限的细胞来源、相关的伦理问题和免疫排斥反应限制了干细胞的临床应用[3]。诱导多能干细胞的应用可解决这些问题，为PD的治疗提供了新的希望。

1 iPSCs的来源

iPSCs是指通过基因重新编排方法，对已成熟分化的细胞进行诱导，得到具有类似胚胎干细胞的多向分化潜能性细胞。2006年，首先由Yamanaka等[4]通过在类似胚胎干细胞(ESC)培养条件下，通过特定的转录因子，即Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等四种因子，将分化的小鼠体细胞重编程为胚胎干细胞(ESC)样多能细胞，即诱导多能干细胞。1年后，他们使用2006年文章中描述的四种转录因子的相同组合从人成纤维细胞中产生了人类诱导多能干细胞(iPSCs)[5]。自发现以来，研究者们改变转录因子导入方式，如利用替代载体，或者利用特定的小分子化合物改善并提高了iPSCs的安全性和低重编程率。Matthias等[6]发现来自小鼠的成纤维细胞和干细胞可使用非整合型腺病毒进行重编程获得4种转录因子。替代载体转座子是一种不含细菌的DNA且可在细胞中高表达，协助从成人脂肪干细胞中产生iPSCs[7]。其他替代载体还包括仙台病毒[8]、质粒[9]、RNA[10]和重组蛋白[11]。有研究表明，生物学试剂5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)可以提高因子诱导的重编程效率。而且BrdU可以替代Yamanaka因子中最重要的Oct4因子，与其他转录因子诱导iPSCs产生。且基因突变实验证实在重编程所使用的浓度下，BrdU并不会导致基因突变及基因组的不稳定[12]。深入研究小分子化合物信号通路可更好地理解重编程的调控信号网络，大大推动了iPSCs的研究发展。

2 iPSCs与PD细胞模型

PD是一种环境因素与遗传因素相结合的复杂疾病[13]。近些年来，来自SNCA、LRRK2、PINK1和Parkin突变患者以及携带GBA突变的高危人类个体的体细胞被成功诱导到iPSCs并分化为DA神经元[14]。人类把这些分化的DA神经元应用于研究PD的发病机制，发现了PD发病过程中调控因子、特殊的病理学特征、介导过程等等；同时，iPSCs被用于药物的筛选和再利用。在这些机制日益清晰的情况下，对人类探索PD的治疗药物及方案有着巨大的帮助。

2.1 LRRK2突变 LRRK2突变是家族性PD最常见的病因。LRRK2的N1437H、R1441C、G2019S等突变在常染色体显性遗传的PD患者中均有报道，G2019S是目前最常见的突变[15]。氧化应激、SNCA蛋白的积累、自噬溶酶体系统受损、线粒体功能障碍等是PD的病理学特征[16]。Ho等[17]使用了来自G2019S载体的iPSC衍生的多巴胺神经元细胞(DAns)，证明mTOR调控因子亮氨酸-tRNA合成酶(LRS)被LRRK2基因型依赖的方式磷酸化，而G2019S相关的过度磷酸化与自噬系统受损有关。

2.2 PINK1突变 PINK1编码线粒体靶向激酶，可保护神经元细胞免受应激引起的线粒体功能障碍[15]。它与Parkin在线粒体损伤和氧化应激中的协同作用。最近研究表明，PINK1患者来源的DA神经元对线粒体应激源鱼藤酮有着明显的凋亡倾向和敏感性。研究人员对FDA药物文库进行表型筛选，发现贝尼地平(钙拮抗剂)能有效抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡，说明基于iPSCs的细胞模型是药物筛选的实用平台[18]。

2.3 SNCA突变 SNCA基因编码α-synuclein，也是路易小体的重要组成成分[19]。SNCA三倍体患者中野生型α突触核蛋白的过度表达可引起帕金森病的相关症状。α-synuclein在神经系统及α-synuclein多聚体在细胞间传播的病理学特征，使得科学家认为降低细胞中α-synuclein的含量和/或消除细胞中的毒性α-synuclein可能是减缓、逆转甚至预防疾病的关键[20，21]。从SNCA三倍体中提取的iPSCs神经元也被用于药物筛选和再利用。Mittal等[22]发现β2-肾上腺素受体(β2AR)激动剂是SNCA的调控因子。利用携带SNCA三倍体的患者诱导的多能干细胞证实了β2AR激动剂可以使SNCA表达正常化，减少α-synuclein的产生，改善线粒体功能。

2.4 GBA突变 GBA突变可能会影响α-synuclein的形成机制。Kim等[23]报道：α-synuclein四聚体和相关多聚体在N370S GBA1帕金森病诱导的多能干细胞(iPSC)来源的DAns和携带杂合L444P GBA1突变的小鼠神经元中均有下降。GBA突变及由于GBA缺乏所致的糖脂鞘类的堆积会引起α-synuclein四聚体的错误折叠，产生病态α-synuclein纤维，使得DAns对毒物的易感性增加。所以维持GBA的活性，避免α-synuclein的错误折叠在PD中至关重要。

2.5 Parkin突变 Parkin基因的表达产物-parkin蛋白是一种E3泛素蛋白连接酶，在泛素-蛋白水解酶复合物体通路中起重要作用[24]。Parkin突变失活致其底物在多巴胺神经元中异常聚集，产生神经毒性，是PD的致病原因[25]。Wang等[26]利用小鼠细胞实验和在体实验证明Syt11是parkin蛋白的底物。Parkin蛋白通过介导Syt11泛素化、蛋白降解，调节Syt11在多巴胺神经的异常积聚，从而抑制DAns的胞吞、囊泡循环和DA分泌，引发PD的病程和DAns的凋亡。

3 iPSCs移植治疗PD的应用

目前PD治疗上主要以缓解症状为主，没有根治的治疗方法。临床上PD的治疗主要有药物治疗及手术治疗两种方式，药物治疗有多巴胺受体激动剂、左旋多巴类制剂、单胺氧化酶 B 抑制剂等等，但仅能改善疾病的症状，不能有效地阻止病情的发展，且长期药物治疗会发生运动并发症如运动波动和异动[27]。PD的手术治疗主要是 DBS(脑深部电刺激)，主要通过对脑深部特定核团的微电流刺激治疗运动障碍疾病，但也有导致神经系统功能缺损的风险[28]。除了传统的临床治疗，如药物和DBS，细胞替代治疗为PD的有效治疗策略的开发提供了一个新的基础。1987年，Brundin等[29]在瑞典首次将胎儿中脑腹侧组织(fetalventral mesencephalic)移植到PD患者纹状体中，PD患者的细胞治疗时代开始。

目前细胞疗法在动物实验中广泛开展研究。Hallett等[30]在PD模型中对猕猴iPSCs衍生的中脑DA神经元进行了长达2年的分析。他们观察到，单侧植入猕猴iPSCs后，运动功能逐渐改善，运动活性增加，无需任何免疫抑制。尸检分析显示了中脑DAns的存活和移植壳细胞的广泛生长。Doi等[31]通过使用底板标记物CORIN+对细胞进行分类，iPSCs衍生的DA祖细胞可以被有效地分离出来。当移植到6-OHDA受损的大鼠体内时，CORIN+筛选出的DA祖细胞存活并在体内分化为中脑DAns，导致运动行为显著改善，而没有形成肿瘤。2017年，日本科学家Kikuchi等[32]在前人的实验基础上,分别使用健康人和PD 患者(非基因突变)iPSCs诱导的 DA前体细胞移植入患有PD的长尾猕猴脑内,并进行了长达两年的观察,发现这些细胞成功地在模型猴体内存活、增殖并发挥正常功能，成功缓解了模型猴肢体震颤的症状，而且无致瘤现象。现iPSCs移植治疗仍在动物实验阶段，相信在不久的将来，会逐步走向临床试验。诱导多能干细胞具有自我更新的潜能，能够分化为包括DA神经元在内的任何体细胞[33]。此外，iPSCs具有类似于hESCs的特性，但可以由成人细胞如皮肤、脂肪组织和成纤维细胞产生[4]，所以无相关的伦理问题。自体移植iPSCs也不会产生免疫排斥反应的风险[33]。

4 iPSCs治疗PD存在的挑战及展望

4.1 年龄因素 许多神经退行性疾病都是成人发病，衰老是PD及相关神经退行性疾病的主要危险因素之一[34]。然而，衰老相关疾病建模的一个主要障碍是iPSC重编程将代表当前捐赠者体细胞年龄的老化特征重置为iPSC的胚胎阶段。年龄相关的分子特征，如端粒缩短、线粒体功能障碍和细胞衰老等，不能在iPSC模型中捕捉到[35]。因此，科学家们尝试对iPSCs分化的细胞进行人工老化，以建立晚发性疾病的模型。Colasuonno等[36]通过观察长期培养的iPSCs发现细胞间通讯的减少、能量代谢改变和自噬发生。

4.2 iPSCs的定向分化 从iPSCs重编程到多个分化过程的细胞系的变异性是iPSCs模型的一个障碍[37]。研究表明，iPSCs重编程的变异性主要来源于细胞的基因组成[38]。Germain等[39]根据对未分化的iPSCs的转录组分析，提出了克隆iPSCs结合标准的分析方法可以降低特异性，且不会对敏感性产生影响。现已经筛选出多种特异性标记物如SOX17、FOXA2、CXCR4、GATA4等对多克隆iPSCs进行联合筛选[40]，可减少克隆的异质性。遗传和表观遗传变异可能导致克隆异质性和细胞系之间的功能差异，验证细胞克隆及分化过程是患者体细胞来源的iPSCs应用的关键步骤。

4.3 致瘤性 2006年Yamanaka等人经典的iPSCs诱导方法中，诱导因子c-Myc本身存在一定的致瘤性[41]；同时，外源的诱导因子基因可插入供体细胞染色体，从而导致宿主细胞因染色体修饰、DNA突变而发生某些基因的关闭或开放，使获得的 iPSC有一定的致瘤性。近年来，大量科学家对iPSCs诱导形成过程进行改良，通过改变诱导因子及导入方式、改变重编程方式和定向分化体细胞、iPSC 分化后检测及清除肿瘤细胞等多种方法，为降低及消除iPSCs的致瘤性提供了可能性。

4.4 展望 干细胞近年来一直是学术界研究的热点，但其涉及伦理、宗教问题等，受到了很大的阻力；iPSCs以其强大的多能性、较少的伦理问题和免疫排斥反应，拥有较好的应用前景。iPSCs可作为相关的帕金森细胞模型，用于药物筛选、疾病进展研究，最重要的是用于移植技术治疗PD。2018年8月日本科学家Takahashi开展了针对PD的诱导多能干细胞衍生细胞的第一个临床试验，招募者为PD中期患者，以移植细胞分泌多巴胺，刺激大脑纹状体神经元为治疗模式[42]。随着临床试验的开展，iPSCs面临的障碍必将一一扫除，在多巴胺能细胞再生方面的应用必定给PD患者带来希望。