Toll样受体在糖尿病创面感染中的作用机制及治疗进展

刘国涛， 王 军

流行病学调查表明中国现有约1.14亿糖尿病患者，临床可见多种糖尿病并发症，其中以糖尿病创面的诊疗费用最高，预后较差；最新统计发现50岁以上糖尿病患者1年内新发足溃疡的发生率为8.1%，治愈后患者1年内再发足溃疡的发生率为31.6%[1]。糖尿病患者的高血糖可增加创面感染发生率并导致创面愈合延迟，糖尿病创面合并的感染会进一步导致难以控制的高血糖，高血糖进一步加重感染从而形成恶性循环；同时感染会加重患者机体的炎症反应，治疗过程中抗生素的大量使用也会导致创面耐药菌的产生，带来巨大的医疗卫生压力，严重影响着患者的生存质量[2]。

糖尿病创面愈合延迟的具体机制目前尚未明确，当下认为局部创面感染、炎症与糖尿病创面的发展预后密切相关，其中感染和炎症反应贯穿于糖尿病创面愈合的全过程，控制感染抑制过高的炎症反应是治疗糖尿病创面的重要方向。近年来研究发现，Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）通路及细胞因子信号传导抑制因子家族蛋白（suppressor of cytokine signaling, SOCS）可以调控多种细胞因子的信号转导，在糖尿病创面的发生发展中起到了重要的作用[3-4]。中医中药对糖尿病创面具有很好的疗效，明确其作用机制有助于推动中药在糖尿病创面治疗中的广泛应用[5-6]。本文作者查阅近年来文献，以TLRs信号通路及SOCS蛋白与糖尿病创面感染和炎症的关系为切入点，对近些年来有关中医药治疗糖尿病创面感染的研究进展的作一综述。

1 TLRs通路和SOCS蛋白在糖尿病创面中的抗感染和抗炎机制

正常的皮肤结构是一个有效的屏障，可以抵御各种病原体侵入。在解剖学上，皮肤由三部分组成：表皮层、富含成纤维细胞的真皮层和真皮脂肪层；角蛋白细胞是主要的表皮细胞类型，其余表皮细胞包括朗格汉斯细胞、黑素细胞、默克尔细胞和浸润的免疫细胞；成纤维细胞是真皮层中的常驻细胞类型，具有高度异质性；真皮下部（网状）的成纤维细胞有可能与前脂肪细胞结合并分化为脂肪细胞，形成最后一个也是皮肤最深的屏障[7]。糖尿病创面局部常定植有多种微生物，致病菌以单菌和多重耐药菌为主。这些微生物多通过TLRs的保守分子模式识别激活人体的抗感染途径，导致抗菌肽和促炎细胞因子的产生招募并激活骨髓和淋巴免疫细胞，例如中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞，启动皮肤防御入侵的反应病原体，但是高糖状态会导致机体免疫系统的过度激活，创面炎症水平紊乱，不仅不能清除创面定植的微生物也会导致糖尿病创面愈合延迟[8-9]。

糖尿病创面病原体激活皮肤免疫与TLRs信号通路关系密切，TLRs属于病原体相关模式识别受体家族。TLR是跨膜受体，与细菌和病毒中的特定分子模式结合，迄今为止，已在人类中鉴定出10种此类受体，其病原体相关配体包括细菌鞭毛蛋白、病毒DNA、脂多糖和CpG-DNA基序。TLR以单一或异二聚体的形式与MyD88、TRAF6和TIRAP等不同的配位分子结合形成复合物，在配体结合时启动信号转导，下游信号分子如p38、MAPK、JNK和NF-κB被激活并转移到细胞核中，在那里它们激活转录调节因子，如c-Fos和c-Jun，促进一些促炎细胞因子的释放以产生抗菌和抗病毒反应，清除创面微生物从而促进愈合[10]。TLR1协同TLR2介导糖尿病创面的革兰阳性细菌脂蛋白或脂肽的天然免疫应答，形成激活簇TLR2:TLR1:CD14以响应三酰化脂肽，该簇从细胞表面触发信号，随后以脂筏依赖性途径靶向高尔基，通过MYD88和TRAF6发挥作用，导致NF-kappa-B活化、细胞因子分泌和炎症反应[11]。TLR2除了协同TLR1和TLR6外，还可激活免疫细胞，促进对脂蛋白脂质部分的凋亡；与TLR6协同识别支原体巨噬细胞激活脂肽-2kD、可溶性结核因子和酚溶性调节蛋白；并能识别结核分枝杆菌主要T抗原EsxA，根据配体形成对二酰化脂肽的TLR2:TLR6:CD14:CD36和对三酰化脂肽的TLR2:TLR1:CD14的簇，激活机体对结核杆菌的免疫[12]。TLR4主要协同LY96和CD14介导革兰阴性细菌脂多糖（LPS）的天然免疫应答，除通过MYD88、TIRAP和TRAF6作用，导致NF-kappa-B活化、细胞因子分泌和炎症反应外，也参与由游离脂肪酸如棕榈酸酯和Ni2+引发的LPS无关的炎症反应；在与TLR6复合物中，促进单核细胞/巨噬细胞的无菌炎症反应以氧化低密度脂蛋白（oxLDL）或淀粉样β42。在这种情况下，oxLDL-或淀粉样β42与CD36结合提供初始信号，TLR4和TLR6异二聚体形成，该异二聚体迅速内化并触发炎症反应，导致通过MYD88信号途径，通过TICAM1信号途径，通过NF-kappa-B依赖性地产生CXCL1、CXCL2和CCL9细胞因子，以及IL-1β分泌，诱导炎症细胞因子释放，清除糖尿病创面的革兰阴性菌[13]。TLR9是一种核苷酸敏感的TLR，由未甲基化的磷酸胞苷鸟苷二核苷酸（CpG）激活炎症反应，研究表明糖尿病创面形成与TLR9和TLR7通过激活浆细胞样树突状细胞有关，预示创面的某些细菌的核苷酸参与创面形成[14]。目前未见TLR5、TLR8和TLR10在糖尿病创面方向的研究。以上结果表明TLRs信号通路主要是识别并传递创面微生物感染信号，启动NF-kappa-B活化产生白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-12等介导炎症反应，目的是清除创面微生物然后促进创面愈合；然而糖尿病创面多重耐药菌的存在导致不必要的炎症反应被激活，影响创面愈合。

TLRs识别不同的病原体相关分子模式的同时会诱导炎症基因的表达[15]，同时SOCS家族可以通过抑制JAK/STAT信号转导通路的激活来实现对炎症分子的调控，促进糖尿病创面愈合[16]。SOCS是调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分，包含SOCS1到SOCS7。SOCS1到6都可以识别ECS（elongin BC-CUL2/5-SOCS-box蛋白）E3泛素连接酶复合物，并介导目标蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体降解；SOCS7 则负责调节信号级联[17]。SOCS3可特异性与JAK2结合抑制其激酶活性，作为抗炎调节因子抑制STAT3的激活，介导IL-6信号转导调控巨噬细胞的转型；并参与促红细胞生成素、胰岛素、IL-12、粒细胞集落刺激因子和瘦素受体在内的酪氨酸激酶受体结合，抑制细胞因子信号转导；调节T辅助 2 型细胞介导的过敏反应的发生和维持，从而抑制创面愈合[18]。SOCS4和SOCS5 通过介导酪氨酸磷酸化表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）及其受体的降解抑制EGF信号传导，导致创面愈合延迟[19]。SOCS5还可以通过抑制促进分化为 Th2 表型的 IL-4信号通路参与调节 T 辅助细胞分化；此外，SOCS5可以促进角质形成细胞在愈合阶段的迁移和增殖[16]。FENG[15]等人在角质形成细胞（HaCaT）和内皮细胞（HECV）中检测到SOCS-3的过度表达和SOCS-4基因敲除突变株，研究发现过度表达SOCS-3可显著降低HaCaT角质形成细胞的增殖率，增强 HECV 细胞的小管形成能力；SOCS-4基因敲除显著减少HaCaT 迁移和HECV细胞微管形成，抑制SOCS-4影响HaCaT和HECV细胞对EGF和TGF-β的反应性，导致HaCaT细胞磷酸化蛋白表达失调。以上结果表明DFUs创面愈合与SOCS-3和SOCS-4关系密切，SOCS5可能是糖尿病创面愈合过程中新的干预靶点。

2 现代医学治疗糖尿病感染创面的研究进展

临床治疗糖尿病创面合并感染患者，在保证下肢血液供应的同时根据创面类型使用不同的清创术清除坏死组织，以控制创面感染[20]。Singh等[21]研究发现TLR4单核苷酸多态性 rs4986790、rs4986791、rs11536858、rs1927911和rs1927914与DFU患者风险增加的相关，通过对125例糖尿病合并DFU患者和130例正常人进行TLR4基因型分析，发现除rs1927914外，所有单核苷酸多态性的危险基因型均与DFU显著相关。单倍型ACATC（P值=9.3E-5）与DFU风险有很强的相关性。发现两种单倍型ATATC（P值=0.0119）和ATGTT（P值=0.0087）对DFU有保护作用；通过观察110例2型糖尿病（患者下肢创面TLR2的表达情况，并检测了TLR2启动子的甲基化状态，结果表明与对照组相比，2型糖尿病创面TLR2基因表达下调，但其表达水平随伤口的感染程度而升高，创面TLR2基因启动子甲基化状态无明显差异[22]；后期Singh等[14]对84例2型糖尿病患者和6例非糖尿病对照者创面TLR7和TLR9在转录和翻译水平上的差异表达进行了分析，结果表明与对照组相比，2型糖尿病患者非感染创面TLR7和TLR9表达明显上调，而伴有微生物感染的创面TLR7和TLR9表达水平较低。TLR9-1237T/C基因多态性是DFU患者的一个危险因素，同时TLR9上调创面S100A8和IL-8的表达，造成创面的持续感染[23]。罗丽娅等[24]将DFU患者、无DF患者和健康体检者进行比较，发现DFU组患者血清TLR9水平升高的同时，25(OH)D水平降低(P<0.05)，血清中的25(OH)D水平降低可能导致患者免疫功能下降，造成创面持续感染，难以愈合。上述研究表明，DFU患者创面的感染情况与TLR2/4/9基因的多态性和表达相关，这些基因可能是促进DFU患者创面愈合的潜在干预靶点。

3 中医药治疗糖尿病创面感染的进展

3.1 中医药治疗糖尿病创面感染的临床研究进展 传统疗法在注重“整体”治疗的同时认为应该重视外治，《医学源流》有“外科之法，最重外治”之说，糖尿病创面的中医内外治法结合现代医学更符合临床分型论治的实际需要。明•陈实功《外科正宗》认为发生在四肢的糖尿病创面是脱疽的一种，特点是外有足指筋肉溃腐同时内有五脏机能衰败；治疗时遵循的原则是尽快切除组织，并缠绕患指末节防止毒气攻延扩散，使用蟾酥饼加艾灸加速局部腐肉枯干，减少切除后的并发症。中医认为糖尿病创面感染符合湿热毒盛辨证，常用清热利湿的中药内服外用控制感染[25-26]。现代临床研究中也将外用中药制剂与VSD等技术相结合用于控制糖尿病创面感染。

王宁等[27]使用复方黄柏液溻渍治疗糖尿病足感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，试验组和对照组各52例，总有效率分别为92%和77%。治疗后，在创面面积缩小及中医证候积分降低的对比上，试验组均优于对照组；表明复方黄柏液可以控制创面耐药菌感染。刘佳莅等[28]将生肌玉红膏与VSD联合使用治疗糖尿病创面，选取70例糖尿病足溃疡患者随机分为两组，每组35例。所有患者均给予常规清创处理及VSD，观察组加用生肌玉红膏联合负压引流术治疗。观察比较两组患者治疗后创面愈合时间、创面愈合率、踝肱指数变化情况；并评价创面血管内皮生长因子、内皮抑素表达情况及超氧化物歧化酶、丙二醛、晚期蛋白氧化产物等氧化应激指标；治疗后观察组患者创面愈合时间缩短，创面愈合率及踝肱指数升高，差异均有统计学意义；观察组创面血管内皮生长因子表达的平均吸光度值高于对照组，创面内皮抑素的水平明显低于对照组；观察组超氧化物歧化酶水平高于对照组，晚期蛋白氧化产物水平低于对照组；表明生肌玉红膏可以通过降低氧化应激减轻创面炎症反应，促进创面肉芽生长。

3.2 中医药治疗糖尿病创面感染的实验研究进展 中药在治疗糖尿病创面的巨大优势，研究中药治疗糖尿病创面的作用机制不仅可丰富中医外治理论，同时为中医药治疗糖尿病创面提供丰富的科学依据。外用单味药及其有效成分以姜黄、黄连、雷公藤等常见，复方多以溻渍法消炎抗菌，通过调控不同通路促进糖尿病创面愈合[29-30]。

3.2.1 单味药及有效成分控制糖尿病创面感染的实验研究进展 现代研究表明糖尿病创面的特点是炎症指标TNF-α升高和愈合指标TGF-β1降低[31]，研究发现一些外用中药可以明显地改善糖尿病创面炎症以及控制感染，且能促进坏死组织脱落[32]，能这一现象可能与外用中药某些成分直接作用于病原体、调控TLR受体通路与SOCS调控炎症反应有关。Zhang[33]等研究发现芍药苷具有抗炎和免疫调节作用，使用db/db小鼠腹腔注射芍药苷，结果表明芍药苷可通过阻断TLR2/4信号通路，降低尿白蛋白排泄率，抑制巨噬细胞浸润和活化；体外实验结果表明芍药苷通过抑制TLR2/4降低了AGEs诱导RAW264.7细胞的活化和炎症反应。Shi等[34]研究发现炎症与树突状细胞和Th17细胞中的IL-6/Stat3通路有关，芍药苷已被临床证明是治疗炎症性皮肤病的有效药物；并已经证明芍药苷对1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB）和幼稚CD4+CD45RA+T细胞刺激的树突状细胞有促进Th17细胞分化的作用；芍药苷在基因和蛋白质水平上均能降低DNCB刺激的树突状细胞中IL-6/Stat3通路表达；这表明芍药苷通过减少Socs3的表达或使Socs3等负性调节因子失活产生抗炎效果，从而调控糖尿病创面创面炎症并能减轻组织损伤程度。Zhao等[35]研究发现姜黄素作为一种有效的抗菌抗炎药，可以通过调节JAK/STAT/SOCS信号通路来抑制树突状细胞的活化；活化的树突状细胞可以促进糖尿病创面创面坏死组织的脱落[36]。朱水兰等[37]发现黄芩苷可以明显抑制炎症通路中SOCS3的表达，并减弱下游炎症效应因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达；王欣之等[38]研究发现雷公藤甲素(TP)在体外诱导SOCS-1和SOCS-3的mRNA表达；通过SOCS-1/3上调IL-2和IL-10抗炎分子的分泌。IL-10进一步调节T淋巴细胞免疫功能，促进糖尿病创面的愈合。石榴皮粗提物联合乙酸乙酯及纳米银为主要原料，制备了用于慢性创面愈合的活性创面敷料水凝胶。对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为63 μg/mL，对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为125 μg/mL；以大鼠为动物模型，通过组织病理学检查证实了活性创面敷料对糖尿病创面的影响。此外，还能增强表皮细胞中转化生长因子β和活化B细胞核因子kappa轻链增强剂的有效性[39]。

随着医用材料和制药技术的发展，纳米技术使得创面敷料具有大孔隙率、良好的吸湿性、良好的氧交换率等特性；从天然资源和合成资源中选择合适的聚合物可以拓宽纳米纤维的应用范围[40]。纳米中药复合材料可能具有更好的抗感染、抗炎性能，可进一步开发用于对抗威胁性超级细菌的抗菌抗感染剂。

3.2.2 复方药治疗糖尿病感染创面的实验研究进展 中药复方治疗糖尿病感染创面多采用湿敷法，目前大多数研究表明炎症反应与TLR4和NF-κB关系密切[41-42]，中药外用可能也是通过SOCS调控TLRs信号通路的强度，减少炎症反应带来的损伤。徐阳[43]等将丹黄消炎液用于皮肤感染泛耐药鲍曼不动杆菌的新西兰兔溃疡模型，发现用药后48 h中药灌胃组TLR-4为(0.1809±0.0357)，IL-1β为(2.0503±0.2632)，中药外敷组TLR-4为(0.1824±0.0194)，IL-1β为(2.6405±0.5425)，表达均较空白组明显升高，用药后72 h中药灌胃组和中药外敷组TLR-4、IL-1β表达均较空白组明显升高，且用药48 h TLR-4、IL-1β达到峰值。用药后10d空白组TLR-4、IL-1β表达明显高于中药灌胃组、中药外敷组；用药后72 h电镜检测显示，中药灌胃组、中药外敷组细菌大量坏死粘连，中药外敷组略优于中药灌胃组；表明TLR-4、IL-1β的表达升高参与机体的炎症，中药丹黄消炎液可以达到抗炎、抗感染的作用。

4 结语与展望

与正常创面相比，糖尿病创面愈合涉及更多的信号通路以及细胞因子。TLRs通路和SOCS蛋白在糖尿病创面愈合过程中发挥了重要作用，中医药基TLRs样受体通路/SOCS蛋白对糖尿病创面等慢性创面进行了一定量的研究。上述通路着眼于糖尿病创面局部炎症表达过度，导致免疫环境紊乱，腐肉难去创面难以愈合；通过中医中药调控局部炎症，促进生长类因子释放达到促进创面愈合的效果。中药提取成分多用于研究对特定细胞SOCS1/3/4的影响，多为抗炎方面的研究，促愈研究相对较少；外用单味中药的抗菌效果和机制研究不够深入；临床治疗糖尿病创面常用解毒佐以扶正类药物（如黄柏、黄芪）、活血化瘀药（川芎、红花）等中药复方，这些复方在蛋白之间相互作用中的关键靶点研究较少。因此，精准深入地研究中医药现代剂型通过TLRs通路/SOCS蛋白促进糖尿病创面愈合机制尤为重要，可以为中医药治疗慢性创面提供更多的依据。