小鼠脑梗死模型中全脑成像技术应用展望

张添源 综述 逯丹，徐安定 审校

暨南大学附属第一医院神经内科，广东 广州 510632

缺血性脑卒中(ischemic stroke)具有高发病率、高死亡率、高致残率的特点[1]。是由于各种原因引起的脑部血流供应障碍，引起局部脑组织的缺血、缺氧性坏死，从而迅速出现相应神经功能缺损的一类临床综合征。越来越多的研究表明，缺血性卒中是中枢神经系统整体的病变，即该疾病不单单是局部的神经元的坏死，还涉及到远隔部位的损害[2]，以及具有代偿功能的其他脑组织启动代偿作用[3-4]。但是传统的切片及成像技术不能有效地进行完整大脑的成像，导致在数据采集过程会丢失很多信息，尤其是神经连接的信息。为此，完整的器官成像技术亟需发展。近年来，显微光学切片断层成像系统(micro-optical sectioning tomography，MOST)以及组织透明技术(tissue clearing techniques)和lightsheet microscopy系统具备采集和重建更为完整的大脑三维结构，能为研究缺血性卒中在细胞水平以及神经元之间的连接提供更好的技术支持。

1 小鼠局灶性缺血模型的构建

由于小鼠脑血管的解剖特点和人类相似，如存在Willis环，使小鼠广泛用于缺血性脑卒中模型的构建[5]。常见的模型构建方法包括大脑中动脉线栓法(intraluminal thread middle cerebral artery occlusion model)、外科手术的大脑中动脉阻塞法(surgical middle cerebral artery occlusion models)、光栓塞法模型(photothrombosis model)[6-7]。

尽管小鼠的大脑约为几厘米，但是传统的光学显微镜和共聚焦显微镜不能对鼠脑进行直接的完整三维成像。而且传统的切片技术费时费力，需要进行微米级别的切片以及每张切片的成像，然后将大量的切片整合处理才可能得到完整的鼠脑信息[8]。实际上，计算机断层扫描(computed tomography，CT)和磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)也具备整体的成像，目前在急性缺血性脑卒中患者广泛应用，但是其分辨率过低不能观察细胞水平而在小鼠模型的研究中受到了限制[9-11]。为了更好更快的获得鼠脑完整的三维成像，不同的科学家们有不同的改进，而归根到底是从两个基本思路入手：(1)以MOST系统为代表的通过自动化切片同时增加成像速度尽可能地得到鼠脑信息；(2)将组织透明化后直接对鼠脑进行“无损”的完整三维成像。

2MOST的系列成像

2010年，中国科学院团队开发了MOST系统并在《Science》杂志上发表论文：“Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain”[12]。该系统能对大型样本进行直接的自动化成像，通过自动化的切片同时极大提高成像速度实现全脑成像。具体做法是首先通过对全脑进行高尔基染色，之后该系统使用金刚石刀具对树脂包埋组织进行切割以使得成像平面较为平整的同时，光学显微镜同步地采集该包埋组织表面信息，最后获得1 um体素辨率的全脑高尔基染色组织信息。后面由于荧光标志荧光成像的需求，出现了荧光显微光学断层成像系统(fMOST)；同时为了降低信号噪比，尽可能地提高信息采集的分辨率，同时加速成像速度等目标下，科学家经过多次的反复改良优化，开发了结构光照明荧光光学切片断层成像系统(structured illumination fluorescence micro optical sectioning tomography，SI-fMOST)，该系统增加了双色成像能力，即同时进行双通道的高通量全脑成像，通过同时采集不同波长、不同发射特性的荧光标志物标志，进行对比反衬作用，进而提高整体的成像分辨率到亚微米级别。同时具备具有天然配准性能，即每张原始图像均具备X坐标、Y坐标和Z坐标，能够进行鼠脑的三维信息进行重建，从而准确还原神经元在全脑的空间位置[13]。

实际上，MOST系统同样需要对样品进行切片，会损伤样品，仍存在丢失部分切片之间信息的风险。但较传统方法而言，该成像方式已经可以呈现出更为完整的全脑信息的要求。

3 组织透明技术和整体成像

在传统的组织切片过程中，组织器官的完整性遭到破坏，而且切片会破坏特殊结构的连续性，如在制片过程中会切断神经元的轴突，从而无法得到完整的神经纤维[8]。为了追求整个组织器官甚至整个模式动物在显微镜进行直接成像，生物组织透明技术蓬勃发展。大脑等组织器官是由于其含有水、蛋白质、脂类等多种不同折光率的多种物质，当光线通过不同组成成分时会发生折射、散射等现象，导致光学观察受到限制[8，14]。组织透明技术(tissue clearing)通过各种处理方式对脑组织进行折射率的匹配以达到透明效果，尽可能减少光线在透过脑组织时的吸收和散射，使显微镜能采集整体大脑器官的信息，从而更加真实的还原目标的三维空间结构[14-15]。

2007年，维也纳科技大学的DODT等[14]通过浸泡苯甲醇和苯甲酸苄酯的混合物(benzyl alcohol-benzyl benzoate，BABB)使鼠脑神经网路可视化，并且能清楚观察到CA1椎体神经元的树突在整个海马中的形态。总体来说组织透明技术的核心是尽可能追求透明化的效果和尽可能减少荧光信号的淬灭。后陆续出现许多不断优化的组织透明技术，以3DISCO[8]、iDISCO[16]、uDISCO和FDISCO[17]为代表的方法，该类技术主要通过有机溶剂对组织样本进行脱水脱脂，再进行折射率的匹配得到透明效果，其突出优点是透明效果佳、样品处理简单、成本较低、时间短，但是荧光淬灭较快也是其突出的缺点。CUBIC、CLARITY在保持荧光强度方面更具优势，其他透明技术包括Scale、ScaleS、PACT-PARS等方法，每种方法均有其的优缺点[15]，使用者可根据自己的需要选择相应的方法。

当组织透明化之后，能容纳鼠脑组织的成像系统也很重要，Light-sheet microscopy[14]和Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy(DSLM)[18]能对鼠脑甚至整个小鼠进行完整的三维成像。同MOST系统类似，这类显微镜系统也在追求高通量信息采集即更快的成像速度以及更高的分辨率。该类成像系统优点在于在不损伤样本的和信息数据丢失的同时，具备更为直接的三维成像数据采集能力，缺点是分辨率有待进一步的提高[14]。

4 整体成像在缺血性卒中的应用和展望

4.1 神经元连接的示踪与成像 特定神经元之间相互联系形成神经回路(neural circuit)。除了成像技术，神经元的标志也同样重要。通过神经示踪技术“点亮”神经传导束形态，从而显示出整个神经环路。传统的神经示踪技术包括葡聚糖胺(BDAs)、荧光金(fluoro-gold，FG)、固蓝(fast blue，FB)等[19-20]。这类示踪剂存在许多缺点，包括因无法进行特异性标志在注射部位局部扩散导致示踪不准确，示踪过程中不能跨突触或跨突触的效率不稳定，而且信号衰减严重不能进行长程示踪等。而重组病毒载体作为示踪剂，可以通过选择不同的病毒特性而进行标志。而重组的病毒工具主要是通过改造嗜神经病毒得到的，根据感染神经元的特性和能否跨突触传播，常见的分类代表如下：顺行跨多级突触的单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)[21]、逆行跨多级突触的伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)[22-23]，顺行跨单级突触的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)[24]以及逆行跨单级突触的狂犬病毒(rabies virus，RV)[25]。其优势是能准确的标志神经元形态，跨突触效率更为稳定。

MOST系统以及透明组织后整体成像在神经科学领域取得了巨大的进步。如通过MOST系统对APP/PS1转基因鼠三维重建，发现神经元树突在杏仁核(basolateral amygdala，BLA)明显减少，该脑区树突的减少可能是阿尔兹海默病的原因之一[26]；通过腺病毒标志神经元在MOST系统成像，重建出纹状体(striatum)-丘脑前内侧核(anteromedial thalamic nucleus)-前额叶内侧皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)环路以及substantia innominate-anteromedial thalamic nucleus-mPFC环路[27]；通过肌肉注射rAAV病毒后，经过FDISCO使脊髓透明化后，可追踪支配肌肉的下运动神经元在脊髓的逆行投射[28]。

在皮层局灶性脑梗死动物模型中，丘脑、黑质等非缺血区域存在神经元、神经纤维的丢失，神经胶质细胞如小胶质细胞和星形胶质细胞增生[2]。同时，通过深部脑刺激(deep brain stimulation)方法刺激小脑齿状核，可以通过齿状核-丘脑-皮层最终作用于皮层，引起突触新生(synaptogenesis)、突触可塑性(synaptic plasticity)标志物等的增加，有利于运动功能恢复[3]。提示缺血性脑梗死的功能变化不仅需要关注导致局部脑缺血引起细胞坏死的区域，更重要的是探索在脑梗死病理状态下运动、感觉等功能相关的神经回路的改变[29]。因此，选择合适的病毒工具标志神经环路，根据自己需要通过透明化后成像或直接进行MOST系列系统成像，可能更好的揭示神经元、神经连接等在缺血性卒中后全脑内的三维变化。

4.2 全脑血管成像研究 CLARTY在细胞水平上定位并重建大脑的血管系统的三维结构整体成像[30]；MOST系统同样可以重建鼠脑的动静脉的脉管系统在大脑的空间分布[31]，也可获取脑出血小鼠模型的神经血管网络(neurovascular networks)信息等[32]。当大脑的供血动脉发生狭窄或堵塞，脑的侧枝循环会代偿达到缺血区域，从而使缺血组织得到不同程度的灌注代偿。目前许多研究的聚焦于缺血周围区新生血管的变化，研究范围较为局限[33]。但是新生血管是否局限于缺血周围区域和代偿形式值得进一步深究。而且似乎鲜有人研究其他供血脑血管包括Wills环血管在脑梗死发生后的整体变化。通过构建小鼠缺血性卒中模型，进行血管的标志后运用上述两种方式进行全脑高分辨率的血管成像，有利于进一步揭示在卒中发生时以及卒中后的整体大脑血管的变化，进一步揭示脑血管病的病理生理过程。

4.3 神经胶质细胞的整体变化 由于神经胶质细胞的形态不像神经元和血管可以追踪，使得神经胶质细胞在全脑成像似乎没那么重要。实际上，在发生缺血性卒中后，缺血区域、缺血周围区域、丘脑、脊髓等多个部位的小胶质细胞和星形胶质细胞均出现改变[2，34-35]。而且，小胶质细胞(microglia)和星形胶质细胞(astrocyte)为代表的神经胶质细胞在缺血性卒中后发挥的功能非常复杂，比如小胶质细胞在卒中后存在不同极化状态可能具备不同功能，星形胶质细胞可能在卒中后不同时期具备损伤或促进康复功能[35-36]。全脑成像无疑利于卒中后胶质细胞变化的研究，比如研究包括胶质细胞在卒中后如何发生迁移，在中风前后同一脑区以及不同脑区之间的数目变化、形态改变和功能发挥是否存在差异等。

5 展望

透明化技术仍在往更简便、更快捷和透明化效果更好的方向发展。不管是MOST系统还是透明化后成像方法均有其不足。总体来说，包括成像分辨率仍可以进一步提高，成像速度进一步加快以及容纳更大型的组织标本成像等。缺血性脑卒中可以影响很多功能，以运动功能为例子，运动功能的障碍机制可能同时引起包括中枢神经系统与外周器官在内的整体变化。因此，未来的挑战除了关注于全脑范围内的神经血管同时变化，可能还在于如何联系中枢神经系统和其支配器官在缺血性脑卒中的变化。